粘膜免疫

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摘要粘膜免疫系统是机体免疫系统的重要部分，近年发现了多种参与粘膜免疫应答和粘膜淋巴细胞归巢的新细胞和分子。本文介绍了这些细胞和分子的特性以及在粘膜免疫中的作用。

关键词粘膜免疫淋巴细胞归巢

一、粘膜免疫应答的细胞和分子机理

覆盖在胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道及一些外分泌腺的粘膜面积超过400m2，是病原体进入人体的主要门户，而且人体粘膜免疫细胞占所有免疫细胞的80%，因此粘膜免疫在机体免疫力方面占有非常重要的地位。根据功能与分布，可将粘膜免疫系统分成粘膜相关淋巴组织（MALT）和弥散免疫细胞。粘膜相关淋巴组织主要指分布于胃肠道呼吸道的集合淋巴小结，包括小肠的Peyer结、支气管相关淋巴组织（BALT）及扁桃体等，由上皮细胞复盖，是粘膜免疫应答的诱导和活化部位；弥散免疫细胞则是粘膜免疫的效应部位。近几年已发现多种细胞参与粘膜免疫应答，这为进一步弄清粘膜免疫机理，研制新型口服疫苗及气溶胶（Acrosol）吸入疫苗奠定了基础。

1.参与粘膜免疫诱导的抗原递呈细胞抗原在粘膜表面如何被抗原递呈细胞（APC）摄取、加工和递呈给T淋巴细胞是诱导粘膜免疫应答的关键，目前发现有几类粘膜上皮细胞参与抗原加工与递呈。

（1）M细胞：全称膜性细胞（Membranecell），为一种特化扁平上皮细胞，位于粘膜淋巴结的滤泡上皮中。在肠道Peyer淋巴结滤泡上皮中，M细胞与肠上皮细胞紧密排列在一起，肠上皮形成规则的微绒毛，而M细胞形成不规则的微折叠。M细胞浆具有丰富的吞饮小泡和线粒体，但溶酶体较少。其本质同是上皮细胞，因为其与邻近上皮细胞间可通过桥粒紧密连接，形成上皮障碍，将肠道内抗原物质与上皮下淋巴组织隔开。但M细胞允许各种不同大小分子通过这种障碍。Neutra研究发现M细胞是大分子颗粒抗原进入上皮下淋巴组织的主要途径。与肠上皮相反，M细胞主要摄取和运输颗粒性抗原如微生物。它缺乏肠上皮表面带负电荷糖蛋白分子层（又叫糖萼），顶部有膜性皱褶，基底部深深凹陷成一个袋，袋中含有T（主要是CD+和CD45RO+记忆细胞）、B细胞及巨噬细胞。这种结构特征使M细胞基底膜距细胞项部仅3微米，大大缩短了含有抗原的吞饮小泡跨越M上皮的距离；有利于抗原快速进入上皮下淋巴组织诱导免疫应答。当粘膜表面的抗原与M细胞膜结合后，M细胞便将其吞入形成吞饮小泡，但抗原很少或完全不在M细胞溶酶体中停留，直接迅速被转运至M细胞基底膜侧，并将抗原释放入上皮下淋巴组织[1]。

M细胞上皮下淋巴滤泡具有生发中心，以IgA+B细胞占多数；T细胞位于副滤泡区，可表达αβ型TCR。另外，滤泡还含有大量的APC如巨噬细胞、树突状细胞（DC）和B细胞，抗原被加工后呈递给T、B细胞，产生抗原特异性B淋巴母细胞，在生发中心繁殖后，通过血流迁移到远处的粘膜和腺体组织，在那些地方进一步分化成熟为浆细胞，分泌IgA。IgA形成双体或多体后选择性地与上皮细胞多聚IgA受体结合，然后跨过上皮细胞释放入粘膜或腺体分泌物中[2]。因此，跨越M细胞转运抗原为启动粘膜免疫应答的最重要第一步。M细胞虽含有溶酶体酶如组织蛋白酶E，但微生物抗原一般仍以完整的活性形式路过M细胞。除肠道外，在支气管相关淋巴组织（BALT）和新发现的鼻咽相关淋巴组织（BALT）和新发现的鼻咽相关淋巴组织（MALT）中也有类似的M细胞存在。

（2）吸收性上皮细胞：主要摄取可溶性多肽抗原并激活CD8+和CD4+T细胞。其中胃肠上皮细胞可表达T细胞激活必须的CD80（B7-1）和CD86（B7-2）共刺激分子。其中胃上皮主要表达CD86，表明其递呈的抗原主要激活CD4+T细胞。肠上皮细胞还表达CD8的配体gp130糖蛋白，与CD8结合后激活与CD8相连折P46lek，诱导CD8+T细胞（抑制性T细胞）活化，与人体对食物抗原的免疫耐受有关。胃肠上皮细胞可组成性表达MHCⅡ，也可在肠道炎症及感染过程中分泌的细胞因子刺激下表达MHCⅡ，表明其具有抗原加工与递呈功能，可以诱导粘膜免疫应答。一般APC内化抗原后，将抗原运送到独特的内体中，内体含有一种非经典性MHCⅡ类分子，即HLA-DM，DN分子可以去除MHCⅡ分子-Ⅰi链复合体中的Ⅰi，使Ⅱ类分子的肽结合槽暴露，从而可以结合抗原性多肽。因此，DM对于MHCⅡ荷载抗原性多肽是必要的。为了测定肠上皮细胞在外源性抗原处理方面是否与传统APC类似，Reyes研究了MODE-K细胞系的抗原摄取和DM表达情况。用DM抗体荧光染色及流式细胞仪分析证实MODE-K细胞可组成性表达DM分子，还证实此细胞可内化各种抗原，被内化的抗原与DM在一起。上述结果表明肠上皮细胞具备抗原加工与递呈给T细胞的基本条件[3]。在T细胞激活过程中，APC细胞上的B7与T细胞上的CD28相互作用是T细胞激活的第2信号，用RT-PCR检测小肠上皮细胞B7表达情况，发现肠上皮可表达B7，而且LPS及EGF可增强这种表达[4]。

（3）上皮内专职APC（professionalAPC）：在粘膜的复层上皮及一些单层上皮，由于大分子抗原不能自由扩散，故粘膜免疫系统必须通过其专职APC主动摄取抗原。已证明要树突状细胞（DC）与巨噬细胞为两种专职APC，它们与上皮细胞紧密相连。DC在呼吸道和口腔上皮特别丰富，可形成类似皮肤的粘膜DC网络。它们可表达MHCⅡ类分子，是主要的APC。上皮中的DC可迁移到粘膜表面，直接与外界接触，摄取抗原后带回到粘膜淋巴组织诱导免疫应答。呼吸道粘膜DC网络还可以发挥监视功能，监测吸入的抗原。在急性炎症期间，DC前体可归回并停滞在呼吸道粘膜，进一步分化成熟为定居性DC[5]。巨噬细胞在肺部及泌尿道大量存在，下呼吸道的定居性肺泡巨噬细胞是弱抗原递呈细胞。在DC、肺泡巨噬细胞及T细胞之间存在复杂的相互调节作用，肺泡巨噬细胞通过产生信使分子一氧化氮（NO）可负向调节DC的功能，抑制呼吸道粘膜中T细胞的增殖。肺泡上皮细胞虽然表达MHCⅠ和Ⅱ分子，但不表达共刺激分子B7-1和B7-2，故不能直接激活肺部特异性CD4-T细胞，反而可诱导抗原特异性T细胞无反应，从而下调肺部免疫应答。

2.弥散免疫细胞与粘膜免疫的效应机理弥散免疫细胞包括上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞，是粘膜免疫应答的效应部位。

（1）上皮内淋巴细胞（IEL）的特性与功能：IEL位于粘膜上皮细胞的细胞间隙。Veazey用流式细胞仪及免疫组化对猴研究表明，IEL约占肠上皮细胞的6%-4%。80%以上的IEL为CD3+CD103+T细胞及NK细胞，只有6%为CD20+B细胞。关于T细胞表型，63%-80%以上为CD8+T，少数为CD4+T细胞。TCR主要是γδ型，少部分为αβ型。研究表明，IEL有与细胞毒T细胞及NK相似的胞内颗粒如穿孔素、粒酶和丝氨酸酯酶，故IEL的主要功能是细胞杀伤作用。IEL也可分泌淋巴细胞因子如TNF-α、γ-IFN、IL-2，因此在防御肠道病原体入侵方面发挥重要作用，如杀死细菌，清除被病毒感染的上皮细胞[6]。另外，IEL可抑制粘膜部位的过敏反应。研究表明食物经消化后成为可溶性抗原，这些抗原主要通过肠上皮吸收，而肠吸收性上皮细胞具有抗原递呈功能，可优先将抗原递呈给CD8+抑制性T细胞，选择性激活它们，从而导致对食物抗原的特异性耐受。

关于IEL的来源，目前认为由两种起源不同的亚群组成。第1种约占40%，是胸腺依赖性的，由CD+、TCRαβ型T细胞组成，如同外周血T细胞一样，多表达THy、CD5、CD4、CD8αβ。实验证明胸腺中存在的IEL的前体细胞，在胸腺分化后到达Peyer结，在肠道内抗原的刺激下进一步分化成熟。第2类约占60%，是胸腺非依赖性的，由CD3+、CD5-淋巴细胞组成，TCR是αβ或γδ型，表达独特的CD8αα分子，缺乏β链，仅10%为THy1+，它们可能直接由骨髓迁移至肠上皮，未经历胸腺阴性选择，含有潜在自身反应性细胞克隆。研究发现重组酶激活基因（RAG1、2）仅局限于肠上皮内表达，表明有TCR基因和Ig基因重排，证明T细胞可在肠道发生及分化成熟[7]。

（2）固有层淋巴细胞（LPL）与TH2型免疫应答：LPL位于粘膜固有层，T、B细胞均很丰富。固有层缺乏RAG1和RAG2表达，表明此处无T细胞发生，其T细胞来源于Peyer结。LPL以CD4+T细胞占优势,CD8+T细胞较少,30%以上的CD78+T细胞是CD8αα。γδ型T细胞明显比上皮内少，仅占2%。CD4+CD8+T细胞明显比上皮多，占14%。B细胞以IgA分泌细胞为主，IgG、IgM分泌细胞较少。另外，也含有丰富的肥大细胞、粒细胞和巨噬细胞。

已发现在粘膜部位的免疫应答以TH2型为主，定居在固有层的CD4+TH2细胞可分泌多种TH2型细胞因子和TGF-β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-10。Husband研究了各种TH2型细胞因子在粘膜免疫中的作用，发现由于IL-4可激活静止期B细胞，故在诱导局部及全身抗体应答中均起关键作用，而IL-5和IL-6则主要在粘膜部位发挥特殊作用，IL-6在促进肠道和呼吸道IgA应答方面起重要作用，这已通过用基因去除技术（knockout）灭活IL-6基因得到证实。在IL-6缺陷小鼠，肠道IgA浆细胞明显减少，当提供外源IL-6后，IgA应答得到恢复。相对来说，IL-5在促进IgA应答方面仅起次要作用，它主要调节IgE产生及对肠寄生虫进行嗜酸性粒细胞应答，它是寄生虫免疫驱除过程中激活效应细胞的主要调节因子，可活化嗜酸性粒细胞，增强其杀虫活性。IL-4、IL-5、IL-6可协同诱导SIgA+B细胞分化成为IgA+浆细胞。因此，固有层是粘膜免疫应答的主要效应场所，浆细胞所分泌的大量IgA可通过分泌片的介导进入粘膜表现，中和抗原物质，起到清除外来抗原保护机体的作用[8，9]。

3.肠粘膜淋巴小结与胸腺外T细胞起源

在人小肠粘膜中，除了Peyer结外，最近又发现了2种新的淋巴聚集组织即孤立淋巴滤泡（Isolatedlymphoidfollicles,ILF）和富含淋巴细胞绒毛（Iymphocytefilledvilli,LFV）。它们可能是胸腺外T淋巴细胞产生和分化的部位。

ILF分布于整个小肠。结构类似Peyer结，含有B细胞和独特的生发中心，也有T细胞，主要为CD4+T细胞，与高内皮静脉相连。大多数T细胞表达CD45RO，在T细胞区的并指状细胞表达MHCⅡ，ILF延伸到粘膜肌层，有些部位则延至粘膜下层。

LFV则相反，不延伸到粘膜下层，局限于粘膜层。主要含T细胞，以CD4+记忆性T细胞（CD45RO）占优势，B细胞较少，无生发中心。LFV含有大量MHCⅡ+细胞如DC。LFV中多数细胞表达CD45（淋巴细胞共同抗原）与THy-1，不表达T细胞标志（如CD4、CD8、CD3、αβ型TCR和γδ型TCR）或B细胞标志（如B220与抗Ig），也不表达胸腺上皮细胞标志。抗小鼠胸腺基质单抗MTS-35不识别LFV中的淋巴细胞。对LFV淋巴细胞进行免疫组化研究表明，它们在表型上不同于胸腺、Peyer结、上皮内淋巴细胞及固有层内淋巴细胞，其表型特征类似于不成熟的T细胞，暗示LFV可能是T细胞产生的重要部位[10]。

二、粘附分子与粘膜淋巴细胞归巢机理

正常情况下淋巴细胞循环于全身各处，一旦发生感染,可迅速粘附并穿过血管内皮聚集在感染部位。淋巴细胞从血管进入组织分3步：①沿内皮细胞滚动：带有L-选择素（L-Seletin）及LFA-1的淋巴细胞可起始粘附于内皮并沿内皮滚动。②停顿（arrest）：感染局部产生化学趋化因子，激活淋巴细胞表达整合素（Integrin），使滚动停止。③淋巴细胞紧密粘附到内皮并穿过内皮进入组织[11]。

除在炎症时渗出外，正常情况下淋巴细胞也有组织特异性归巢（homing），可分别归巢到各外周淋巴器官与粘膜，这主要取决于淋巴细胞上的粘附分子与靶器官血管内皮细胞上配体之间的相互作用。淋巴细胞归巢到粘膜是由淋巴细胞表达的粘附分子与粘膜血管内皮表达的组织特异性配体相互作用而启动的。

近几年已发现几类粘附分子参与了淋巴细胞的归巢与定居，其中主要是整合素分子。整合素是Ⅰ型跨膜糖蛋白，由αβ亚基组成，参与细胞之间的粘附。目前至少已鉴定了15个α亚基与8个β亚基，可配对形成20多个整合素分子。β链可与几个不同的α链结合，据此可将整合素分成不同的亚家族。β1亚家族由β1及α1-α9相连而成，又叫VLA，其配基多为细胞外基质如纤维粘连蛋白。β2亚家族包括αLβ2、αMβ2和αXβ2，主要表达于淋巴细胞等白细胞表面，其配体为Ig超家族成员如ICAM-1、2、3，在淋巴细胞的再循环中起作用。最近又鉴定了几个新β链如β4、β5、β6和β7。β7选择性表达于淋巴细胞上，分别与α4及αE结合形成α4β7和αEβ7，构成β7亚家族，由于它们参与粘膜淋巴细胞归巢与定居而引起注意[12]。

1.整合素α4β7及配体MAdCAM-1已知α4β7是小鼠淋巴细胞归巢到粘膜组织的主要受体。α4β7主要表达于循环B细胞及一些循环记忆性CD4+T细胞上，针对它的抗体可阻断小鼠淋巴细胞结合到Peyer结内的高内皮静脉（HEV）。Williams发现表达α4β7及CD44high的记忆T细胞可以非常有效地归巢到Peyer结，而α4β7记忆T细胞基本上不能进入粘膜淋巴组织，它们主要归巢到外周淋巴结[13]。Farstad研究了人Peyer结中T、B细胞上的α4β7分布，发现HEV附近CD45RA+T细胞及滤泡中SIgD+B细胞表达中等水平α4β7和丰富的L-选择素，而靠近输出淋巴管的记忆性CD45RO+T细胞和SIgD-B细胞则表达高水平α4β7,很少表达L-选择素。由于α4β7和L-选择素共同表达于Peyer结HEV附近的淋巴细胞，表明两者参与人淋巴细胞归巢到肠相关淋巴组织（GALT）[14]。α4β7的主要配体为内皮细胞上的粘膜地址素细胞粘附分子-1（mucosaladdressincelladhensionmolecule-1,MAdC-AM-1），次要配体为内皮VCAM-1及纤维粘链蛋白（FN）。MAdCAM-1属于Ig超家族，为50KD的跨膜糖蛋白。它有4个结构区，第1区和2区为Ig区，有α4β7结合位点，第3区是粘蛋白样区，有选择素结合位点。MAdCAM-1主要在肠Peyer结、肠系膜淋巴结的HEV，肠固有层小静脉和乳腺小静脉的内皮表达，因此α4β7主要介导淋巴细胞归巢到这些粘膜淋巴组织[15]。

2.整合素αEβ7及其配体E-钙依赖粘附素（E-Cadherin）αEβ7主要在肠上皮内淋巴细胞（IEL）及肠固有层淋巴细胞（LPL）高水平表达，部分外周血淋巴细胞也表达，其中B细胞表达水平高于T细胞。Andrew发现αEβ7也在支气管上皮内淋巴细胞及肺泡壁淋巴细胞表达。约50%的肺泡记忆T细胞表达αEβ7，可介导特定T细胞亚群在支气管上皮定居[16]。免疫沉淀分析表明αEβ7由135KD的α链与100KD的β链组成。目前αE与β7的基因被克隆。关于αEβ7的功能,体外实验表明抗αEβ7单抗可阻断T细胞粘附于上皮细胞，因此它主要介导上皮内淋巴细胞（IEL）粘附及定居于肠上皮。用一组针对上皮细胞的单抗可以阻断IEL与上皮的粘附。证明αEβ7的配体是上皮细胞表达的E-钙依赖粘附素。钙依赖粘附素是另一类粘附分子，有5个细胞外区，尾部及连环蛋白（catenin）及肌动蛋白相连。在固体组织形成过程中，钙依赖粘附素可介导Ca++依赖的同型的细胞粘附，其特点是有严格的组织特异性表达。E-钙依赖粘附素主要在上皮细胞基底面表达，可识别IEL的αEβ7，介导IEL与上皮细胞粘附，有助于淋巴细胞归巢到粘膜部位。转染实验表明用αEβ7基因转染Cos细胞后，被转染的Cos细胞可结合上皮细胞，这种结合可被针对αEβ7或针对E-钙依赖粘附素的单抗所阻断[17]。另外，α4β1（VLA-1）也介导淋巴细胞在内皮上的滚动，参与淋巴细胞归巢。已发现大多数肺部T淋巴细胞表达α4β1。

3.L-选择素主要介导淋巴细胞归巢到外周淋巴结，但也参与淋巴细胞归巢到粘膜淋巴细胞如Peyer结，针对L-选择素的单抗也可部分阻断淋巴细胞归巢到Peyer结。幼稚淋巴细胞表达的L-选择素与HEV内皮表达的MAdCAM-1糖基部分相互作用，导致淋巴细胞在内皮上滚动，然后α4β1与MAdCAM-1进一步相互作用，抑制滚动，淋巴细胞即可穿过内皮进入淋巴结内。可见L-选择素在淋巴细胞起始粘附及沿内皮滚动中起重要作用[18]。

4.β7亚家族在粘膜淋巴细胞定居中的作用对于已进入肠固有层的淋巴细胞，从固有层向上皮的迁移是由上皮细胞分泌的化学趋化因子驱动的。如LI-8。由于α8β7的次要配体为纤维粘连蛋白，故在淋巴细胞穿过固有层的细胞外基质向粘膜上皮的运动中起作用。上皮细胞还可合成TGF-β1，由TGF-β1再诱导淋巴细胞表达αEβ7，由于αEβ7可与肠上皮基底面表达的E-钙依赖粘附素结合，从而将淋巴细胞固定于上皮内[11]。

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