β环连蛋白肾癌发生中作用

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摘要：目的：探讨β-环连蛋白在肾癌发生发展过程中的作用及其变化机制。方法：采用免疫组织化学、蛋白印迹、反转录聚合酶链式反应等方法对本院收治的26例肾癌患者手术标本进行了研究。结果：26例患者中有25例癌组织中细胞胞浆内β-环连蛋白表达明显高于正常组织，而且肿瘤分期越高，癌细胞内β-环连蛋白的表达也越强，pT3和pT4期的肿瘤内的表达明显高于pT1和pT2期的肿瘤，P＜0.01，但β-环连蛋白mRNA的表达水平并无明显变化。结论：细胞内β-环连蛋白表达的增加与肾癌的发生发展有关，可能是肾癌形成和发展的重要机制之一。

关键词：肾肿瘤癌β-环连蛋白

β-环连蛋白（β-catenin）作为细胞内的一种蛋白质，即是Wnt信号传导途径中的重要成分，又与细胞间黏附作用有关，这两种作用都与肿瘤的发生和发展密切相关。目前，在大肠癌、肺癌等肿瘤的研究中已经发现癌细胞胞浆内β－环连蛋白表达增加，但其在肾癌中的表达情况尚未见报道。为了探讨β－环连蛋白与肾癌发生、发展的关系，我们采用免疫组织化学、蛋白印迹（westernblot）及反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）方法对26例肾癌患者进行了研究。

资料与方法

随机选择1996～1997年间本院肾癌手术标本26例，病理证实为肾细胞癌，其中男性20例，女性6例，年龄19～77岁，平均59.3岁。透明细胞癌18例，颗粒细胞癌4例，混合细胞癌4例。按临床分期：T1期7例，T2期13例，T3期5例，T4期1例。每份标本为2份，癌组织1份，相应的正常肾组织1份，经10％福尔马林固定，石蜡包埋，癌组织切片2～3张，正常肾组织切片2张，分别做病理检查和免疫组化检验。留取部分新鲜标本于液氮内用于提取胞浆蛋白和mRNA。

1．免疫组织化学方法：β-catenin单克隆抗体购自美国Santacruz公司，免疫组化采用链菌素抗生物素蛋白-生物素酶标法（LSAB），其主要操作步骤：（1）石蜡切片脱蜡入水；（2）3％过氧化氢酸甲醇室温下孵育30min，封闭过氧化物酶；（3）枸橼酸盐缓冲液（0.01mol,pH6.0）中92～98℃10min修复抗原；（4）加2％牛血清白蛋白（BSA）约50μl室温下孵育30min以阻断非特异性抗原的反应；（5）加β-环连蛋白抗体（1∶100）约50μl于湿盒内4℃过夜;（6）加生物素标记的二抗（1∶300）约50μl室温下孵育60min;（7）加链菌素抗生物素蛋白-过氧化酶液（1∶500）50μl，室温下孵育60min;（8）DAB显色，苏木素复染及中性树脂封片，各步之间用磷酸盐缓冲液（PBS）洗5min，3次。阴性对照用PBS替代一抗，其它相同。结果分析采用半定量方法，以胞浆内出现棕黄色为阳性细胞，切片内阳性细胞数大于20%计为阳性，小于20%计为阴性，阳性结果又根据染色深浅分为阳性（＋）和强阳性（＋＋）。正常肾组织和癌组织以及肿瘤不同分期之间的染色结果比较采用直接概率法检验和卡方检验。

2．Westernblot:应用单去污剂裂解缓冲液从组织中提取胞浆内蛋白质，加等量蛋白提取物于10％聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中电泳，用电转仪将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，加1%～3%BSA封闭非特异性结合位点，再加β-环连蛋白抗体和辣根过氧化物酶标记的链亲和素。最后应用化学发光试剂盒进行化学发光，利用Molecularanalyst图象分析软件分析条带灰度值，用平均值±标准差表示，组间差别用t检验。

3．RT-PCR：应用异硫氰酸胍一步法［1］提取组织mRNA，AMV逆转录试剂盒和TaqmDNA聚合酶购自promega公司。Thermalcycler1型PCR仪，美国PE公司。IBM586计算机控制的Geldoc1000成像系统，美国Bio-Rad公司。步骤：（1）逆转录：25μl反应体系中加入等量的变性后的RNA（3μg）及OligodT0.1μl、AMV0.5μl（20U/μl）、5×Buffer10μl、RNsin100u及无RNA酶的水，混匀、离心5s，42℃孵育1h，95℃5至7min使逆转录酶失活后立即置冰浴，待用或－20℃保存。（2）PCR反应：参照文献［2］设计β-catenin引物，上游引物为：5′GCTaCTTGTGAGTGAAG3′，下游引物为：5′ATGGAACCAGACAGAAAAGC3′，共200bp。以β-actin为对照，上游引物为：5′CTGTCTGGCGGCACCACCAT3′，下游引物为：5′GCAaCTAAGTCATAGTCCGC3′，共254bp。引物由北京生物制品研究所合成，反应体系为10×Buffer5μl、25mmolMgCI24μl、dNTP1μl（各10mmol/μl）、Taq酶0.3μl（5U/μl）、逆转录的cDNA为模板2μl、上下游引物各0.5μl（50pmmol/μl）、加水至50μl。混匀、加入50μl石蜡油覆盖液面，离心10s。将反应管置于PCR仪内，先95℃7min变性，再接95℃变性1min30s、54℃复性1min、72℃延伸1min30s，共35个循环后接72℃延伸10min。反应终止后置－20℃保存。(3)PCR产物定量：PCR扩增结束后，β-catenin和β-actin各取10μl样品于1.5％琼脂糖凝胶中电泳60min，电压为5～7V/cm，每毫升凝胶内含0.5μg的溴化已啶（EB），用电脑照胶仪分析各条带的灰度值，比较肿瘤与正常组织样品的β-环连蛋白与β-actin的比值，应用秩和检验方法对两组数据进行分析。

结果

1．免疫组织化学：26例肾癌患者癌组织细胞浆内β-环连蛋白染色强阳性者9例，阳性16例，阴性1例，相应正常肾组织中阳性2例，其余均为阴性。β-环连蛋白在肾癌细胞内的表达主要集中在胞浆内,核内也有染色，肿瘤间质未见阳性染色。β-环连蛋白在肾癌中的表达较正常肾组织中的表达明显增加，差异有显著性意义（χ2=21.74，P＜0.01）。

在癌组织中的表达与病理类型及年龄无关，与临床分期有关，20例pT1和pT2期的肿瘤中强阳性者4例，阳性者15例，阴性1例；6例pT3和pT4期的肿瘤中5例为强阳性，1例阳性。临床分期为pT3、pT4期的肿瘤较pT1、pT2期肿瘤β-环连蛋白的表达明显增加（P＜0.01）。

2．Westernblot:β-环连蛋白在肾癌癌细胞浆内的表达比其在正常肾组织细胞内的表达量明显增加（P＜0.01）。

3．RT-PCR：以每例标本癌组织和正常肾组织中β-环连蛋白与β-actin灰度值的比值，经秩和检验两组数据比较，差异无统计学意义（P＞0.05）,说明癌组织中β-环连蛋白基因的表达并无增加

讨论

β-环连蛋白在细胞内具有两种功能［3］：其一是参与细胞间黏附作用；其二是Wnt信号传导过程中的重要成分，这两种作用均与肿瘤的发生发展有关，特别是在Wnt信号传导中的作用，近年来不断受到人们的关注。正常组织中细胞内由于结肠腺性息肉基因（APC）、哺乳动物糖元合成激酶3(GSK3β)等的作用，游离的β-环连蛋白很快即被降解，一般不会出现聚集。在癌组织中由于多种原因使癌细胞胞浆内β-环连蛋白增加、聚集，与转录因子TCF/LEF形成复合物、进入细胞核内，与DNA结合，促进靶基因的持续转录。靶基因的持续转录与细胞的增殖与转化密切相关。有报告3个大肠癌细胞系中均有β-环连蛋白表达的增强，认为大肠癌癌细胞的增殖与转化与β-环连蛋白靶基因的持续转录关系密切，β-环连蛋白的靶基因可能就是大肠癌的癌基因［4］。Xingpei等［5］报告了65例大肠癌患者细胞核内有β-环连蛋白的高表达，且与肿瘤的分期分级有关。在对6例进行性纤维瘤的研究中也发现细胞胞浆内有β-环连蛋白表达的增加［6］。本实验的结果从定性和定量两个方面都证明在肾癌癌细胞胞浆内有β-环连蛋白的高表达，提示在肾癌的发生发展过程中有β-环连蛋白的参与，而且其高表达的程度与肿瘤的分期分级有关。肿瘤的分期越高其表达量相对也高，说明由β-环连蛋白引起的靶基因的持续转录与肾癌癌细胞的增殖与发展也密切相关。

关于癌细胞胞浆内β-环连蛋白表达增加的原因，目前的看法主要是其降解减缓，而非生成增加。有研究显示发现尽管肿瘤细胞内β-环连蛋白的表达量增加，而其mRNA水平并无变化［6，7］，本实验的结果与上述结果一致，再一次证实β-环连蛋白基因在肿瘤中的表达无明显增加，β-环连蛋白的高表达并非其本身合成增加所致。影响β-环连蛋白降解的因素有Wnt信号的增强，APC的突变以及β-环连蛋白本身的突变等。在对大肠癌的研究中发现β-环连蛋白的高表达主要与APC的突变有关，突变后APC不能降解β－环连蛋白。在Rubinfeld等［8］对黑色素瘤细胞系的研究中发现β-环连蛋白的增加主要与其本身的突变有关，β-环连蛋白突变后可增加其稳定性，使其不被降解。Wnt信号的增强可以抑制APC对β-环连蛋白的降解作用［9］。β-环连蛋白在肾癌癌细胞胞浆内高表达的原因目前研究尚少。至于β-环连蛋白本身的突变尚有待进一步研究。

总之，β-环连蛋白作为Wnt信号传导过程中的重要成分，在肾癌的发生发展过程中一定有其重要的作用，相信进一步的研究对揭示肾癌的发病机制及指导临床治疗有重要的意义。

参考文献

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［8］RubinfeldB,RobbinsP,EL-GamilM,etal.Stabilizationofβ-cateninbygeneticdefectsinmelanomacellline.Science,1997,275:1790-1792.

［9］PapkoffJ,RubinnfeldB,SchryverB,etal.Wnt-1regulatesfreepoolsofcateninsandstabilizesAPC-catenincomplexes.MolecCelBiol,1996,16:2128-2134.