酒精性肝病和肝细胞凋亡关系
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与TGFβ和抗Fas单克隆抗体对肝细胞的凋亡诱导作用相似［1］,低浓度的乙醇能够在体外诱导培养的大鼠肝细胞发生凋亡［2］。由于肿瘤细胞的易培养性,往往以肝癌细胞代替肝细胞建立乙醇诱导肝细胞凋亡的实验模型。乙醇能够诱导肝癌细胞系HepG2细胞凋亡,并且其诱导凋亡的效果强于丝裂霉素C［3］。用不同浓度的乙醇作用于HepG2细胞和人正常肝细胞系HPH细胞不同时间之后,每例取6×103个细胞进行透射电镜分析。发现乙醇对肝细胞的凋亡诱导作用强于对肝癌细胞的作用（P<0.05）,而且肝细胞和肝癌细胞凋亡的发生程度与乙醇的浓度和作用时间显著正相关（P<0.01）［4］。
2酒精性肝病中的肝细胞凋亡
Kawahara等［5］用免疫组化法检测了凋亡相关抗原Lewis在20例ALD患者（平均每天摄入酒精80g以上）的肝活检组织的表达情况,发现含Mallory小体的肝细胞呈Lewis抗原阳性表达,提示至少部分含Mallory小体的肝细胞以凋亡的方式被清除。TUNEL法检测结果表明,ALD组织的凋亡发生率明显高于正常肝组织,并且在气球样变性、胆汁淤积、炎症区和结节性肝硬化部位更为明显［6］。Goldin等［7］用连续23天乙醇蒸汽吸入法建立了小鼠ALD模型。在21只正常对照小鼠中,只有36%的肝末端小静脉可见凋亡小体,并且这些凋亡小体中的88%位于中央静脉周围两排的肝细胞。实验组41只小鼠中,72%的肝末端小静脉可见凋亡小体,并且这些凋亡小体大多数不只是位于中央静脉周围两排的肝细胞,肝细胞凋亡程度与肝细胞损伤程度密切相关。在停止吸入酒精蒸气后,肝细胞凋亡现象逐渐减轻,并且经过一段时间之后肝组织结构可完全恢复正常。说明ALD中凋亡小体产生的数量和位置具有时间依赖性,肝组织损伤具有可复性。Baioni等［8］在用定量分析法证实了大鼠慢性酒精中毒肝细胞凋亡率上升的趋势之后,用以BrdU检测分裂期细胞的方法表明,其肝细胞增殖率也明显上升。在大鼠ALD的逐步发展过程中,不仅凋亡的肝细胞不断增多,而且肝细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）阳性率也不断增高［9］。在小型猪ALD模型中也可见到不仅肝细胞凋亡小体随着ALD的发展而明显增多,肝细胞的PCNA阳性表达率也逐渐增高［10］。提示在ALD中肝细胞凋亡现象及其再生修复同时存在。
3酒精性肝病中肝细胞凋亡的发生机制
关于ALD中肝细胞凋亡的发生机制尚未完全阐明,目前认为其主要与以下几种因素有关:（1）肝细胞色素p4502E1（CYP2E1）的活化。在正常肝脏中,CYP2E1主要分布在中央静脉周围的肝细胞,此处正是ALD病理损伤的好发部位。在ALD组织中,CYP2E1活性普遍较高。CYP2E1具有很强的MADPH氧化酶活性,可使乙醇氧化生成羟乙基根,使肝细胞反应性氧中间产物和脂质过氧化终产物增多,产生对肝细胞的毒性作用,引起肝细胞凋亡。经逆转录病毒载体介导把CYP2E1基因转染到HepG2细胞中,并使其稳定表达。在乙醇诱导下转染CYP2E1基因的细胞较未转染的细胞更容易发生凋亡CYP2E1拮抗剂，抗氧化剂都能够对抗乙醇对肝细胞的凋亡诱导作用［11］。从大豆中提取的一种多聚不饱和卵磷脂能够降低乙醇特异性CYP2E1的产生和对抗氧化,从而减轻乙醇引起的肝细胞凋亡,说明CYP2E1确实在乙醇诱导肝细胞凋亡中具有重要的作用［12］。（2）肝脏铁负荷增加。铁可催化自由基的生成,并增强肝细胞的氧化应激反应。在大鼠饮食中加入碳酸铁,可加重其ALD所致的肝损伤,使肝细胞凋亡程度增加［13］。（3）肿瘤坏死因子（TNF）和TNF受体的活性增高。用乙醇诱导凋亡的HepG2细胞与凋亡前相比,TNF-α表达水平增高了35倍,IL-1α和IL-6的水平也分别有所增高［14］。乙醇能够阻止TNF-α激活肝细胞内对氧化还原作用敏感的转录因子NFkB,使肝细胞增殖活性下降,肝细胞对BclxL等生存基因的表达减弱,破坏TNF-α和其他与肝细胞生长调节有关的细胞因子对肝脏的营养和保护作用［15］。（4）促氧化物增多和抗氧化物减少造成的氧应激反应。乙醇代谢过程中产生的氧化剂能够诱导肝细胞发生凋亡,并使DNA产生片段化。谷胱甘肽等细胞内的抗氧化剂能够对抗乙醇引起的肝细胞凋亡［16］。用共聚焦显微镜研究的结果显示,能够对抗乙醇引起的氧化压力的试剂可有效地减轻乙醇引起的肝细胞凋亡或坏死。并且,细胞内抗氧化剂的抑制剂能够加重乙醇诱导的肝细胞凋亡［17］。（5）肌纤维母细胞和TGF-β的诱导凋亡作用在ALD中,来自肝星状细胞的肌纤维母细胞不仅能够合成和分泌一些胶原和非胶原基质蛋白,而且可使成纤维生长因子TGF-β的分泌增加。TGF-β是一种公认的肝细胞凋亡诱导剂。Gressner等［18］分离了大鼠的肌纤维母细胞,并在体外观察此肌纤维母细胞对肝细胞的凋亡诱导作用。发现当肌纤维母细胞分泌TGF-β时,用DNA荧光染料Hoechst33342染色可见肝细胞出现典型的凋亡形态学变化,TUNEL法检测显示有很多明显的阳性细胞出现,并可用琼脂糖凝胶电泳观察到凋亡细胞特有的梯状DN段化。当肌纤维母细胞不分泌TGF-β时,肝细胞未见明显的凋亡发生。提示肝脏的肌纤维母细胞可能通过增加TGF-β的分泌来诱导肝细胞凋亡。（6）某些凋亡相关分子的变化。ALD肝组织的CD95受体及其配体表达水平普遍增高,细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）能够通过CD95受体和配体的相互作用启动细胞凋亡［13］。Deaciuc等［19］用给大鼠连续7天喂食含乙醇液体饮食的方法建立了ALD模型。分离ALD大鼠的肝细胞、枯否细胞和肝血窦内皮细胞之后分别检测其Caspase3表达水平,发现均较正常对照组明显增高。乙醇诱导的HepG2细胞凋亡过程中Caspase1和Caspase3表达水平明显增高,并可分别被ICE蛋白抑制剂和bcl2基因转染所抑制［11］。提示上述凋亡相关分子的变化可能在ALD肝细胞凋亡发生过程中具有一定的作用。
4内毒素、炎症介质和细胞因子
炎症介质和（或）细胞因子对酒精性肝病的形成具有重要的作用［20］。酒精的摄入可致炎症细胞对炎症刺激过度的反应产生大量的炎症介质和（或）细胞因子,即所谓的激发和致敏。一方面,肝细胞损伤后,可发生肝实质细胞的凋亡和坏死,激活肝内的Kupffer细胞和血循环中的单核细胞。另一方面,酒精性肝病时,因肠细菌过度生长、肠黏膜通透性增加、肠细菌移位以及正常的免疫功能受抑制等,导致肠源性内毒素血症［21］。内毒素不仅可直接损伤肝细胞,更重要的是内毒素还与Kupffer细胞特异受体CD14及TLR4（Tolllikereceptor4）结合激活该细胞。进而可释放大量的氧自由基、细胞因子和炎症介质,如TNF-β、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-β、TGF-β、PDGF等。不仅如此，细胞黏附分子和细胞因子受体表达也增加。多种细胞因子和炎症介质可引起肝细胞进一步坏死、凋亡、炎症和肝纤维化形成。尤其是肠源性内毒素血症在ALD的形成过程中的作用至关重要,内毒素可使Kupffer细胞释放TNF-β和NO,诱发肝细胞坏死与凋亡,并发现TNF-α与各种细胞膜上的受体结合可增加细胞内活性氧形成,诱导细胞死亡。不仅如此,对酒精性肝病时Kupffer细胞TNF-β表达上调的进一步研究发现,慢性酒精的摄入能增加内毒素刺激的细胞外受体活性激酶1/2（ERK1/2）的活性,促进早期生长反应因子1（Egr1）的表达,并使Egr1与TNF-β启动子结合力增加。临床和动物实验均表明ALD血循环中TNF-α明显升高,运用TNF-α中和抗体能减轻酒精所致大鼠的肝损伤。通过饮食含乳酸杆菌食物或用多粘菌素B或新霉素等抗生素,改善肠黏膜的屏障功能、抑制肠道细菌过度生长以减少内毒素的生成等措施,均能明显减轻实验性酒精性肝病的严重程度。应用氯化钆（GdCI3）选择性破坏枯否细胞,可在很大程度上阻断酒精性肝病的发生,阻断内毒素的信号转导,均能减轻酒精性肝损伤［22,23］。
5总结
综上所述,乙醇不仅能够在体外诱导肝细胞或肝癌细胞凋亡,而且动物体内实验也证实,ALD中肝细胞凋亡率明显增高,肝细胞凋亡与ALD病变的发生和发展过程密切相关。目前,在乙醇诱导肝细胞凋亡与ALD关系的研究中有待于解决的问题主要是:（1）ALD动物模型的建立。尽管已经用含乙醇液体饲料喂养、酒精灌胃和乙醇蒸气吸入等方法建立了许多大鼠、小鼠和狒狒等动物的ALD模型,但是其与人类ALD的病理变化仍有一定程度的差异。其中,以用狒狒建立的模型最接近于人类ALD,但是狒狒模型还存在价格昂贵,不易操作和结果不易重复的缺点。目前尚缺乏既能比较完全地模仿人类ALD的病理变化,又简便易行的动物模型;（2）ALD中肝细胞凋亡的发生机制尚不明确。尽管已经明确了ALD中肝细胞凋亡的发生与CYP2E1的活化,铁负荷增加,TNF和TNF受体活性增高,促氧化物增多和抗氧化物减少造成的氧应激反应,肌纤维母细胞和TGF-β的诱导凋亡作用以及某些凋亡相关分子的变化密切相关,但是其具体的作用机制和信号传导通路尚不清楚;（3）ALD中肝细胞凋亡与抗凋亡的平衡机理。在ALD中,肝细胞不仅发生凋亡,其增殖功能也变得异常活跃,PCNA指数和BrdU数值都明显增高,说明伴随着乙醇诱导肝细胞凋亡的发生,肝细胞发生了再生。在ALD中,肝细胞凋亡率明显增高的同时,肝脏胆管上皮细胞和炎症细胞的bcl2蛋白表达水平也明显上升［9］。说明ALD中还存在着肝细胞凋亡和肝脏抗凋亡的动态平衡问题。目前对这一问题尚缺乏比较深入的认识。
随着新的凋亡相关分子的逐渐发现,以及对ALD发病机制的深入研究,乙醇诱导肝细胞凋亡与ALD的关系会得到进一步明确,ALD中肝细胞凋亡的发生机制也必然会得到进一步揭示。
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