生物技术及应用

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工业生物技术已经成为继生物制药、生物农业后的第三次生物技术浪潮，具有巨大发展前景的领域，将对物质制造和加工，生物能源及生态与环境保护产生极其深远的影响。工业生物技术的核心是生物催化，作为生物催化剂的酶在工业生物催化中起着关键性的作用。

工业生物技术是人类实现可持续发展的重要途径。众所周知，以化石原料为基础的物质制造业在现代工业社会中占据着重要的位置，但它正面临着严峻的挑战：化石原料可用量日益减少，环境污染日益严重。以再生资源为基础的循环产业的形成是解决现代工业社会危机的重要途径。生态环境脆弱和资源短缺是我国的基本国情，也是限制我国产业经济可持续发展的瓶颈。工业生物技术被OECD（OrganizationofEconomicCooperationandDevelopment）定位为构建和环境协调产业体系的关键技术，是实现人类可持续发展目标的重要领域。世界各国对工业生物技术都给予了极大的重视。目前，据统计至少有129个利用生物技术进行工业化生产的例子。但是，工业生物技术的工业化成功的例子仍然很有限。这主要是因为自然界的生物催化剂大都只能在温和的条件下起作用，往往难以直接用于工业过程，比如通常酶或细胞很难在高温、高压、有机溶剂等条件下起作用，其稳定性低，容易失活。但是，随着对生物酶来源的多样性、酶催化机理、结构及功能之间关系认识的逐步提高和现代工业社会发展对生物技术需求的高涨，建立发现、改造和使用生物催化剂技术平台成为工业生物技术研究的热点领域之一。

化学物质是人类社会赖以发展的基础。但人工化合物的大规模制造和使用造成了严重的环境污染，成为被全球普遍关注的严峻问题。众多的人工化合物释放到生态环境中后，微生物还没有足够的时间和充分的环境条件来“进化”其代谢途径，因此表现出有机化合物的难生物降解性。化合物对环境产生的风险（Risk）可由以下的公式来表示，取决于化合物本身的危害度（Hazard）和在环境中的暴露程度（Exposure）。

Risk＝Hazard×Exposure

因此，为降低化学物质对环境带来的危害或负担，开发清洁生物生产工艺生产环境友好的化合物具有重要的意义，与此同时必须开发减少化学物质在环境中的暴露程度（浓度和时间），即化合物的生物降解或生物处理技术。随着难降解化合物的污染问题的表面化和人们对环境污染问题认识加深，于上世纪90年代形成了环境生物技术这一学科方向。环境生物技术是生物技术与环境科学和化学工程等领域交叉的学科，是工业生物技术领域的新方向。2002年10月的美国科学杂志（Science）刊登了环境微生物技术的研究特辑，英国的自然生物技术杂志（NatureBiotechnology）于2003年2月刊登了具有芳香化合物降解能力的假单胞杆菌（Pseudomonassp.）作为多样生物催化剂的可能性,近几年，国外还涌现出了大量的有关环境生物技术的书籍，足见环境生物技术研究在国际上已成为重要的前沿研究领域。

本文以利用融合蛋白技术高效生产工业用肝素酶及剩余污泥减量化好氧－厌氧反复耦合废水生物处理技术研发过程为主，介绍工业生物技术在医药化学品、生物能源及环境中的应用研究进展。

1）肝素酶的重组大肠杆菌高效生产、分离耦合及其应用技术研究

肝素酶I（heparinaseI,EC4.2.2.7，商品名Neutralase,Hepzyme，IBEX,加拿大蒙特利尔公司生产）是一种特异作用于肝素（heparin）和类肝素分子的多糖列解酶。肝素酶具有重要的应用价值，肝素酶及其底物多糖肝素之间的相互作用有助于阐明多糖裂解酶的作用机制；肝素酶可以用于解析肝素等复杂粘多糖的结构及其生物学功能；肝素酶可以用于解析人体内的凝血和抗凝血机制；肝素酶可以用于制备具有高效抗凝血作用的低分子肝素；肝素酶还可以用作临床血液肝素化的去除，防止手术后出血。我国是肝素原料的生产大国，开发酶法低分子肝素生产技术具有重要的意义。

商业化的肝素酶I从肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）中纯化得到，但表达需要价格昂贵的肝素诱导，同时由于肝素酶II和III的共表达增加了纯化的困难和成本[1]。肝素酶I的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，但产生的都是无活性的包涵体，需要蛋白质复性才能获得有活性的酶[2-4]。

我们利用融合蛋白技术构建了一套大肠杆菌的表达系统，能够高效的表达可溶性的肝素酶I，并同过亲和分离简化了肝素酶的纯化操作。实验研究结果表明在我们的肝素酶表达生产体系中，90％以上的肝素酶I以有活性的可溶性蛋白形式存在，从而省去了复性的操作，降低了操作成本；目前酶活可达16000IUl-1，远远高于肝素黄杆菌的表达水平；通过一步亲和分离，回收的肝素酶纯度达95％以上。同时利用绿色荧光蛋白（GFP）基因，构建了利用荧光快速定量酶活的新方法，而且肝素酶与GFP的融合蛋白有助于肝素酶失活机理的研究。

利用融合蛋白的亲和吸附能力容易实现肝素酶I的定向固定化，使开发高效肝素酶反应器成为可能。通过实验证明融合肝素酶I能够和商品酶一样有效的降解肝素，制备出理想的低分子量肝素（LMWH）。通过控制酶解反应条件，得到了一系列分子量分布范围窄的低分子量肝素（平均分子量在5000－6000）。本研究为肝素酶的工业化生产及其应用奠定了技术基础。

2）好氧-厌氧反复耦合生物反应器处理废水新工艺研究进展

活性污泥法作为有机废水的生物处理技术被广泛的应用。但是活性污泥法的最大缺点是产生大量的剩余污泥，因其含水率高，体积大，易腐烂，易产生恶臭味,造成污泥处理和处置困难。目前由于经济效益问题难以彻底解决污水处理普遍存在的污泥问题，因此从源头上减少污泥产率或实现剩余污泥原位降解的污水生物处理技术的开发是值得重视的方向。

剩余污泥的产生速度取决于微生物的产率和内源呼吸速度，降低剩余污泥量的主要思路是减少微生物的得率和增大微生物的内源呼吸。由于微生物的内源呼吸常数比其比增殖速度一般要小1到2个数量级，因此减少活性污泥的产率是实现剩余污泥减量化的积极方法。目前针对剩余污泥问题，污水的生物处理方法研究主要集中在三个方面（如图2）：一是对已经产生的剩余污泥进行处理后再返回到曝气池作进一步的处理，二是在污水处理过程中减少污泥产量，三是通过剩余污泥的原位降解开发不产生剩余污泥的污水处理技术。为了研发剩余污泥原位分解型废水生物处理技术，我们利用多孔微生物载体，构建了在废水的流动方向上具有好氧/微好氧/厌氧区域交替出现的生物反应器，对该反应器的废水处理过程特性及其机理进行了实验室规模的研究，并进一步进行了中试研究和工业应用。

长期的实验室实验表明，该反应器对有机物的去除效率很高，未经沉淀的处理水中的SS浓度很低，长期维持在很低的水平以下。在实验室研究的基础上，开展了不同废水的中试试验。其中对某生化制药厂的发酵废水进行的中试试验结果表明，废水的COD浓度变化范围是500~5600mg/L，氨氮为50mg/L左右，容积停留时间为17.67～22.08h，废水流量为120～150L/h时，经过好氧－厌氧耦合反生物应器处理后，出口的COD为150~300mg/L，处理水SS浓度在50mg/L以下，而且出水色度好，硝化反应彻底（氨氮浓度在5mg/L以下）。装置运行正常，没有出现任何污泥堵塞的现象，没有排过污泥。在此基础上，天津某制药公司采用我们的技术用于其高浓度制药工业废水的处理，目前投入运行，效果良好。大量的基础和应用实验结果说明利用多孔载体和好氧－厌氧反复耦合原理能够开发出剩余污泥原位降解型废水生物处理技术，该技术将对废水生物处理行业产生深远影响。