腹膜间皮细胞培养分析

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摘要：目的：建立简便有效的人腹膜间皮细胞（HPMC）的体外培养方法。方法：用0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTANa2消化人大网膜组织，细胞悬液经100目筛网滤过后进行培养。用形态学、免疫组化（SP法）鉴定细胞。结果：分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状。免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性，证实培养的细胞的确是HPMC。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离HPMC的方法。

关键词：腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜

腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善[1]。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关，其中腹膜间皮细胞的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素[2]。因此，建立人腹膜间皮细胞培养体系，为体外研究人腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。

早在20世纪80年代初，Wu等[3]通过直接从患者腹水中获取腹膜间皮细胞的方法，成功地培养出人腹膜间皮细胞。此后Kern[4]和Stylianou[5]等分别采用胶原酶消化组织法和直接种植法，培养出人腹膜间皮细胞，Stylianou并完整地阐述了人腹膜间皮细胞的鉴定方法。虽然目前人腹膜间皮细胞培养方法很多，但由于培养人腹膜间皮细胞的条件苛刻且易受成纤维细胞污染等原因，要获得大量、高纯度的人腹膜间皮细胞仍为实验研究中的难题。我们综合文献方法并加以改进，建立了人腹膜间皮细胞体外培养方法。

1材料与方法

1.1取材

无菌取自江苏省中医院普外科、肛肠科腹部手术切除的大网膜。

1.2主要仪器设备

眼科剪、镊，培养皿，50mL培养瓶，吸管，10mL尖底离心管，CO2培养箱，超净台，离心机，倒置相差显微镜，100目不锈钢筛，0.22滤膜过滤器。

1.3主要试剂

1.3.1PBS液氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.56g，磷酸二氢钾0.2g溶于1000mL三蒸水中，过滤灭菌分装，室温保存。

1.3.21640培养基InvitrogenCorporation公司产品，按说明配制，并使其含有青链霉素各100U/mL，小牛血清20%。

1.3.3细胞消化液胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）2.5g，EDTA二钠盐0.16g溶于1000mLPBS液中，过滤除菌，分装于小瓶内，-20℃保存。

1.3.4免疫组化抗体波形蛋白抗体，第8因子抗体，CD45抗体均为福建迈新公司产品。

1.4腹膜间皮细胞的原代培养

无菌摘取腹部手术切除的大网膜，剪取血管脂肪相对少的网膜组织，大小约3cm×3cm，将剪取的网膜组织置于含500U/mL青霉素和500L/mL链霉素的无菌生理盐水中浸泡20min，然后用生理盐水流动冲洗5min，将漂洗后的网膜组织平铺于无菌培养皿内，再用PBS反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的网膜组织剪成1cm×1cm大小，加入0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA细胞消化液20mL，用吸管反复吹打均匀，装于50mL培养瓶内，放置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱内消化25min，每5min振摇1次，最后5min保持静止。消化结束后将消化液用100目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含20%体积分数的胎牛血清的RPMI-1640完全培养液终止消化。用移液器分装于10mL尖底离心管，1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于50mL培养瓶，放置于37℃，5%CO2培养箱内培养。

1.5腹膜间皮细胞的传代培养

原代细胞培养24h后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内一半的陈旧培养液，此后每3d全换液1次。约培养5~8d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在37℃，5%CO2培养箱内消化15min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入4mL完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，传代于6孔板（将盖玻片裁成4片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡5~10min，取出，在干燥箱内60℃烘干1h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于6孔板内，每孔3片）内，加入适量完全培养液。继续在37℃，5%CO2，湿度95%的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。

1.6腹膜间皮细胞的鉴定

1.6.1免疫组化鉴定①吸去6孔板内培养液，PBS（pH7.2~7.4）洗2次，每次3min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗2遍，随即放入10%中性福尔马林固定30min；蒸馏水洗4次，每次3min。②加入0.1%TritonX100（PBSpH7.4配制），室温10min，PBS洗3次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45无须修复，波形蛋白和第8因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育60minBPS洗3次每次5min，去除PBS。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂A，室温下20min，PBS洗3次，每次3min。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂B，室温下30min，BPS洗4次，每次5min）。④DAB显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的DAB显色溶液，在显微镜下观察3~10min；自来水洗5min，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过70%、80%、90%、95%酒精各1次，100%酒精2次，每次1min；透明，过二甲苯溶液3次，每次3min。⑥封片，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。自然通风干燥。普通光学显微镜观察，拍照。

1.6.2扫描电镜鉴定①细胞准备：同间皮细胞传代，取出细胞爬片浸入PBS中漂洗细胞表面；②固定：将细胞爬片放入青霉素小瓶中，加入4℃预冷的3%的戊二醛，4℃过夜。吸出固定液，用PBS浸洗2次，每次10min。再加入4℃预冷的1%的四氧化锇，在4℃固定1h。PBS浸洗2次，每次10min。③脱水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐级脱水，各10min。④置换：将样品放入醋酸异戊醋:丙酮=l:1的混合液中10min，然后放入醋酸异戊酯中2次，各10min；⑤临界点干燥：预冷临界点干燥室的样品室，使其温度降到0℃，将玻片放入样品篮，样品篮的上下两面事先铺好滤纸，在保证细胞被醋酸异戊醋浸润的情况下，将样品篮放入样品室。拧紧室盖，充入液态CO2，同时缓慢排出CO2气体，反复3次，使液态CO2置换出细胞中的醋酸异戊醋，加热样品室，使CO2达到临界状态。缓慢的排出CO2，待样品室压力降为零，取出样品。⑥离子溅射镀膜：从样品篮中取出玻片，用银胶将干燥样品粘到样品托上。

导电胶干燥后，将样品托放入离子溅射仪的真空罩内，抽真空。当真空度达0.1托后，加高压1000V，离子溅射镀膜。⑦电镜观察：启动扫描电镜，安装样品，观察细胞表面结构，拍照。

1.6.3透射电镜鉴定①消化间皮细胞，1000r/min，离心5min，3%戊二醛固定，PBS洗涤2次，每次20min；②1%锇酸固定30min，PBS浸洗2次，每次10min；③脱水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐级脱水，各10min；④100%丙酮固定10min；Epon812浸泡、包埋；⑤LKB-V型超薄切片机切片（70m）；H-600透射电镜（日本）下观察、拍片。

2结果

刚从大网膜消化下来的间皮细胞在倒置显微镜下为葡萄串状，50%的间皮细胞大约24h左右贴壁，个别细胞伸展。72h所有贴壁细胞均伸展，呈多形性（梭形、椭圆形、多角形等），边缘不整，细胞呈现拉网状生长，与相邻的细胞相互连接。以后细胞拉网生长现象减少，生长融合呈多角形，大小较为一致，似铺路鹅卵石样外观。细胞经传代培养后，2~4代细胞的形态与生长方式与原代细胞基本无异。5代开始间皮细胞增殖明显缓慢。

2.1免疫组化鉴定

光镜下观察所培养细胞的波形蛋白染色为阳性，是间皮细胞的特征。波形蛋白抗原阳性，CD45、第8因子抗原阴性可排除成纤维细胞、血管内皮细胞和白细胞。

2.2超微结构

扫描电镜下细胞完全铺展，与周围对比不强烈。细胞呈椭圆形或多角形，胞核圆形，位于细胞中央、较小，有核处细胞隆起较厚。细胞表面大量密集的微绒毛，细胞周围高密度的绒毛在背景中形成高密度的晕圈。透射电镜检查：细胞表面存在大量多少不等的微绒毛，细胞浆内丰富的内质网和线粒体，未见Weibelpalade小体。

3讨论

间皮细胞培养中要注意以下几点：①正确确定首次换液时间，避免换液过早，首次换液越晚越好，最好第3天进行，动作轻柔，减少振荡。原代培养头3天尽量勿动培养液，以免干扰间皮细胞贴壁，换液越早丢失的间皮细胞数目越多；②胰蛋白酶消化后，消化液中的间皮细胞不要，因为最先消化下来的往往是活力不好的细胞。终止消化后用培养液吹打下来的细胞活力好，生长快；③注入培养瓶中的间皮细胞要具备一定细胞密度，不要太稀。生长良好的细胞可提供“化学信使”去促进其它细胞生长，因此细胞密集时它们彼此能提供和接受该“化学信使”越长越好；假若过稀，则可因缺乏该化学信使而停止生长、死亡。此外，腹膜供体的年龄越年轻越好。

虽然目前国内、外的文献已介绍了多种间皮细胞的培养方法，但这些培养方法均较为复杂且重复性不高，不能满足科学研究的需要。本实验所建立的体外人腹膜间皮细胞培养模型，操作简单，培养迅速，4~7d即可传代，可重复性强。

【参考文献】

〔1〕MillerG,BomanJ,ShrierI,etal.Naturalhistoryofpatientswithadhesivesmallbowelobstruction〔J〕.BrJSurg,2000,87:1240

〔2〕刘洪斌,李东华,郭世铎.腹腔粘连形成机制及治疗研究进展〔J〕.中国中西医结合外科杂志,2005,11(1):84-86