急性心肌梗死患者外周血来源分析

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摘要：目的观察急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)患者外周血来源内皮祖细胞(endothelialprogentiorcells，EPCs)CXCR4受体表达及功能的变化。方法选择AMI患者15例，对照组非AMI患者15例，抽取外周血密度梯度离心法获取单个核细胞，培养7d后对贴壁的细胞进行分析。激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝集素I和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色阳性细胞为EPCs。应用改良的Boyden小室测定EPCs对基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-I)的迁移能力，流式细胞仪测定EPCs的CXCR4的表达，RT-PCR法测CXCR4的mRNA表达。结果AMI患者外周血EPCs数目增多，对SDF-1的迁移能力增强，其表达CXCR4上调，CXCR4的mRNA合成增强。与对照组相比，差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论AMI患者外周血来源EPCs的CXCR4受体表达上调，功能增强。

关键词：心肌梗死；内皮祖细胞；CXCR4

众多证据表明，循环中内皮祖细胞(endothelialprogentiorcells，EPCs)在成体血管形成中起了重要作用。动物和临床实验均表明，静脉注射EPcs，能显著促进缺血组织的血管新生及功能恢复，而同样条件下注射成熟内皮细胞却收效甚微。这些均表明了EPcs在机体生理或病理情况下对血管形成的重要作用。因而EPcs也成为研究的热点。正常人外周血循环中有一定数量的来源于骨髓的EPcs，参与维持血管壁的完整性。但冠心病人的EPCs数量减少，功能减低，且这种损害与冠心病的危险因素呈相关性。作为冠心病的一种特殊类型急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)，在急性期由于存在自体骨髓动员现象，EPCs却是升高的。但升高后的EPCs功能如何，少有报道。笔者研究了AMI急性期EPCs的CXCR4受体的变化，来试图解释其功能的变化，以期为提高EPCs治疗效果提供一种新的思路。

1资料与方法

1．1一般资料

AMI患者15人，对照组为因非典型胸痛而行冠状动脉造影并排除冠心病的患者15人，2组临床资料。排除近期内有炎症、肿瘤、手术及合并糖尿病，服用雌激素、他汀类药物等影响EPCs因素的患者。

1．2材料与试剂

淋巴细胞分离液(相对密度1.077)购自上海生化试剂二厂；EGM-2-MV内皮细胞培养基购自Clonetic公司；胎牛血清(Fcs)购自GIBCO公司；人纤维连接蛋白购自Chemicon公司；FITC标记荆豆凝集素I(FITC-UEA-I)、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)购自Sigma公司；基质细胞衍生因子-1(stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1)、FITC标记的抗CXCR4抗体购自深圳晶美生物公司；改良的Boyden小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂；TRIzol试剂购自Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒、TaqDNA聚合酶和dNTP购自Fermcntas公司。引物由北京奥科公司合成。

1．3方法

1．3．1EPCs的分离、培养与鉴定每例患者取外周血15ml，分别常规密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞以1×105个细胞/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板。加入EGM-2-MV培养基及5％FCS于5％CO培养箱中37℃恒温培养。培养4d后，用PBS洗掉非贴壁细胞。为了维持细胞原先生存环境，换为EGM-2-MV培养基，加入20％的细胞来源患者血清，继续培养至7d后进行各种检查分析。贴壁细胞用DiI-acLDL、FITC-UEA-I行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。每孔随机选择15个视野(×200)对EPCs计数。取其平均值换算成每平方毫米的细胞个数记录。

1．3．2EPCs对SDF-l的迁移能力检测用胰酶消化贴壁细胞并计数。将含SDF-1质量浓度浓度为100ng/ml的培养液(EGM＋20％患者血清)30μl注入改良的Boyden小室的下室，将含3×10个EPCs的培养液(同上)50μl注入上室，培养5h，刮去滤膜上面的未移动细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到低层的细胞。

1．3．3流式细胞术分析消化后的部分EPCs离心，沉淀重悬于PBS中，取约5×105细胞，加入FITC标记的抗CXCR4抗体及同型对照，于流式细胞仪(FACSCalibur，B－D公司)上进行阳性细胞记数，每次分析获取10个细胞。

1．3．4RT-PCR检测应用Trizol提取上述收集的EPCs总RNA，测定RNA浓度后反转录为cDNA再进行PCR反应。CXCR4引物序列：上游引物5’－AATCTYCCTGCCCACCATCT－3’，下游引物5’－GACGCCAACATAGACCACCT－3’，产物为367bp。内参照为GAPDH，上游引物：5’－TATGATGACATCAAGAAGGTGG－3’，下游引物：5’－CACCACCCTGTFGCTGTA，扩增片段213bp。反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳。图像分析软件(BandLeaderApplication3.0)分析电泳条带灰度值，目的基因mRNA表达的相对强度＝目的基因条带灰度值/内参照条带灰度值。

1．3．5统计分析采用SAS8.1forwindows统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差(χ±s)表示，两组间均数比较用成组t检验，计数资料采用Fisher法进行检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1EPCs的鉴定及计数

培养4d后可见贴壁的单个核细胞，7d后单个核细胞变为梭形，内皮样细胞。对贴壁细胞行荧光化学染色后激光共聚焦显微镜下观察，见>80％的细胞双染色阳性，说明这些细胞能内吞ac—LDL和结合UEA-1，可被认为是正在分化的EPCs。随机选择15个视野计数双阳性细胞，见AMI组患者外周血来源EPCs为(439±54)个/mm，明显高于对照组

(263±37)个/mm，P<0.01。

2．2EPCs对SDF-1迁移能力的比较

与对照组相比，AMI组外周血来源EPCs对SDF-1的迁移能力明显增强。[175±19)vs(98±11)个/mm，P<0.01]。

2．3流式细胞仪测定EPCs表面CXCR4的表达

AMI组为(69.5±12.1)％，对照组为(58.7±10.4)％，AMI组较对照组明显增高(P2．4EPCs中CXCR4mRNA表达测定

AMI组CXCR4mRNA表达的相对强度为(0.8±0.11)，对照组为(0.5±0.09)，AMI组明显高于对照组。(P<0.05)。

3讨论

本实验中发现，AMI后急性期外周血中EPCs数量增多，对SDF-l的迁移能力增强，同时EPCs的CXCR4受体表达增高，mRNA合成增强。AMI后，由于缺血缺氧、组织损伤、炎症因子释放增多，可致自体骨髓干细胞动员，因而外周血中EPCs数量增多。EPCs如何归巢到受损心肌处以发挥生成血管的作用，目前认为主要是靠SDF-1与其受体CXCR4相互作用来完成。研究发现AMI后急性期内，心肌局部SDF-1表达明显增高，SDF-1可通过EPCs上CXCR4受体剂量依赖性地提高EPCs的迁移、归巢向缺血组织的能力。与心肌局部SDF-1升高相对应的是EPCs上CXCR4表达上调，笔者在体外实验中证实了这种上调可导致EPCs对SDF-1的迁移能力增强，因而推测AMI后外周血中EPCs的CXCR4表达上调，加速了EPCs向损伤心肌处归巢，以保护或代偿生成血管。

EPCs的CXCR4上调，考虑由多种原因造成。一方面AMI后从骨髓中动员到外周血中EPCs比例、数量增多，另一方面，AMI后可释放多种细胞因子，其中便包含VEGF、SCF、IL-6等。而实验表明VEGF、SCF、IL-6可直接作用于CD34细胞，诱导CXCR4的表达。尽管AMI后心肌局部SDF-1表达增多，但由于基质金属蛋白酶、中性蛋白酶等的作用，血液及骨髓局部中SDF-1却是降低的，SDF-1的下降，也可使其配体CXCR4相对上调，这些情况更有利于干细胞的动员，而不利于动员出的干细胞再回归于骨髓中。

心肌局部表达SDF-1升高是短暂的，AMI后7d便降低，同时自体骨髓干细胞动员也仅限于急性期，长期冠心病对EPCs的数量与功能是有损害的，这也是依靠机体自身的代偿起不到治疗作用的原因之一。但是可以利用SDF-1与CXCR4相互作用来干预治疗。动物试验表明，转染SDF-1基因或直接注射SDF-1，均能提高局部SDF-1的水平，促进自体或移植的EPCs归巢增强局部血管生成。国内学者进行动物试验表明应用G-CSF或他汀类药物，均能大幅提高心肌梗死后外周血中EPcs的数目，促进梗死区血管再生。而且有报道表明G-csF在体内能间接引起EPcs的cxcR4表达上调。相反，用相应抗体阻断cxcR4的表达后，治疗AMI的作用明显降低。因而围绕sDF-1与cxcR4相互作用，如何提高AMI后自体或移植的EPCs的cxCR4表达，如何提高AMI后心肌局部的SDF-1的表达，从而促进AMI后EPCs的血管生成作用，将是一个较有前景的治疗方法。