骨质疏松大鼠骨计量学探讨论文

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摘要：目的观察运动与中药联合作用对骨质疏松大鼠骨组织形态计量学的影响。方法雌性SD大鼠随机分为正常对照组、去卵巢手术组、雌激素对照组、运动组、中药组、运动+中药组。正常对照组行假手术，其余各组行双侧卵巢切除术，术后3个月开始为期3个月的治疗。雌激素对照组用尼尔雌醇治疗，中药组和运动+中药组应用中药治疗，运动组和运动+中药组按要求进行运动。治疗结束后对腰椎骨作骨组织形态计量学分析。结果运动+中药组骨小梁的数目在治疗各组中最多，骨小梁分离度在各治疗组中最小，矿化沉积率在各组最高。结论运动与中药联合治疗方法对骨质疏松大鼠腰椎骨，具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用。

关键词：骨质疏松大鼠;骨组织形态计量学;运动;中药

骨质疏松是一种多因多果全身性骨骼疾病，其发病机制目前也不完全清楚，虽然各种方法对骨质疏松的预防和治疗均有一定的干预作用，但从总体上看其疗效均较为局限。运动在骨质疏松的预防、治疗和康复过程中均可发挥积极明显的作用。中药骨康具有补肾壮骨、健脾益气、活血通络的作用，是一个较理想的防治骨质疏松的药物。本研究旨在探讨运动与中药联合作用对骨质疏松的作用及其机制。

1资料与方法

1.1药物及试剂雌激素尼尔雌醇片(上海华联制药有限公司生产，批号：961001);盐酸四环素(上海华舜生物工程有限公司提供，批号：MW.480.9);钙黄绿素和过氧化苯甲酸(广州化学试剂厂提供，批号：200104012和200003012);Goldner′s染色剂(美国Sigma公司);甲基丙烯酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯(天津化学试剂一厂提供，批号分别为：040328和20030320);硫酸铬钾为汕头光华化学厂产品，批号：991001;中性树胶由上海明胶厂生产，批号10004160B。

1.2主要仪器硬组织切片机(德国LeicaRM2155);慢速锯(美国BuehlerLTD.);碳化钨钢刀(德国Leica)自动图像数字化分析仪(德国Leica);计算机(中国方正电脑公司);骨形态计量学测量软件(美国OsteoMetrics，Inc.)。

1.3动物及分组选用6月龄健康雌性SD大鼠67只，体重260～290g，清洁级(由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2003A010)。随机分为6组，正常对照组(11只)、去卵巢手术组(12只)、雌激素对照组(12只)、运动组(11只)、中药组(11只)、运动+中药组(10只)。实验动物分笼饲养，自由进食标准饲料和饮用水。参照文献〔3〕制作去卵巢骨质疏松模型,用10%水合氯醛溶液按0.33ml/100g腹腔注射麻醉，正常对照组大鼠行假手术，其余各组大鼠双侧卵巢完整切除，进行手术造模。手术后正常饲养3个月后开始治疗，治疗时间为3个月。正常对照组、去卵巢手术组和运动组以蒸馏水10ml/kg灌胃，1次/d;雌激素对照组按体重1mg/kg的标准给予浓度为0.167mg/ml的尼尔雌醇灌胃，1次/w，其余各天给予蒸馏水10ml/kg灌胃;中药组和运动+中药组按4.8g/kg骨康(相当于临床剂量的10倍)，灌胃给药，每天1次;运动组和运动+中药组按要求给予跑步训练。本实验模拟田径运动中周期性耐力跑的形式，参照Bedford〔4〕的动物负荷标准，采用段氏PT98型鼠类跑台进行运动训练。训练大鼠的运动强度逐渐加大，2w内达到设计负荷。开始跑速为12m/min，持续20min，坡度为0°，以后隔日增加运动强度3m/min，增加运动时间10min。2w后达到跑速20～22m/min，坡度为50，每天1h，每周连续训练5d，休息2d。在动物处死前14和13d，以及处死前第3天和第4天分别于背部皮下注射25mg/kg盐酸四环素和5mg/kg钙黄绿素进行双荧光标记，以测量骨组织动态参数。

1.4骨标本制备实验结束时，处死动物，取其第2腰椎椎体(L2)用低速锯切开暴露骨髓腔置于福尔马林缓冲液中固定24h后,经乙醇脱水后行不脱钙骨包埋。包埋块用硬组织切片机分别切成4μm的薄骨片和8μm的厚骨片。薄片用Goldner染色，透明后封片，用于测量骨形态计量学的静态参数。厚片直接透明后封片，用于测量骨小梁变化的动态参数。

1.5观察指标测量和观察第2腰椎骨组织形态计量学静态和动态参数〔5〕。静态参数包括骨组织面积(T.Ar,mm2)、骨小梁面积(Tb.Ar,mm2)、骨小梁周长(Tb.Pm,mm)、破骨细胞数量(Oc.No,N)及其相应计算参数。计算参数为骨小梁面积百分数(Tb.Ar,%)、骨小梁宽度(Tb.Th,μm)、骨小梁数目(Tb.N,N/mm)、骨小梁分离度(Tb.Sp,μm)、每毫米破骨细胞

数(Oc.N,N/mm)、单位骨小梁面积破骨细胞数(Oc.N/mm2,N/mm2);动态参数包括单荧光周长(sL.Pm,mm)、双荧光周长(dL.Pm,mm)、双荧光间距(IL.Wi,μm)及相应计算参数：荧光周长百分数(L.Pm,%)、矿化沉积率(MAR,μm/d)、骨形成率(BFR/BS,μm/d×100;BFR/BV,%/年;BFR/TV,%/年)。

1.6统计学处理所有数据以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件，组间比较显著性测定用方差分析和t检验。

2结果

2.1各组大鼠第2腰椎骨组织形态计量学静态参数的变化从表1中可见，应用雌激素、运动、中药以及运动+中药4种治疗方法都能提高去势大鼠的骨小梁百分数，以运动+中药的疗效最好，但仍不能恢复到正常水平(P<0.01)。4种治疗方法在对第2腰椎骨组织形态计量学静态参数的影响方面，雌激素以增加去卵巢大鼠腰椎的骨小梁周长为主，中药治疗主要体现在增加骨小梁的宽度上，而运动以及运动+中药的治疗作用主要表现在增加骨小梁的数目上。参数骨小梁的分离度由大到小的变化趋势为：去卵巢手术组>雌激素对照组>中药组>运动组>运动+中药组>正常对照组，其中仅有运动+中药组与正常对照组比较差异不显著(P>0.05)，而其他各组均明显高于正常对照组(P<0.05)。

2.2各组大鼠第2腰椎骨组织形态计量学动态参数的变化见表2，荧光标记百分数的变化，中药组是各组中最高的，而雌激素对照组在4种治疗组最低。运动+中药组大鼠的骨矿化沉积率明显提高(P<0.05);而雌激素则对骨矿化有抑制作用，雌激素对照组骨矿化沉积率比去卵巢手术组还低，与运动组和运动+中药组比较差异显著(P<0.05)。运动组、中药组、运动+中药组的BFR/BS明显高于正常对照组和雌激素对照组(P<0.05)。去卵巢手术组、运动组、中药组、运动+中药组表1治疗3个月后大鼠第2腰椎静态指标的变化表2治疗3个月后大鼠第2腰椎动态指标的变化与正常对照组相比：1)P<0.01，2)P<0.05;与去卵巢手术组相比：3)P<0.01,4)P<0.05;与雌激素对照组相比：5)P<0.01,6)P<0.05

BFR/BV明显高于正常对照组(P<0.05);运动组、运动+中药组和去卵巢手术组的BFR/BV还显著大于雌激素对照组(P<0.05)。中药组、运动组、运动+中药组的BFR/TV均较高，与雌激素对照组比较有显著性差异(P<0.01)。每mm破骨细胞数变化趋势为：正常对照组>去卵巢手术组>雌激素对照组>运动组>运动+中药组>中药组。而单位骨小梁面积破骨细胞数变化趋势为：去卵巢手术组>正常对照组>雌激素对照组>运动组>运动+中药组>中药组。

3讨论

有文献报道〔3〕：3月龄和6月龄大鼠去卵巢6个月，均可发生骨质疏松，6月龄大鼠骨质疏松程度更严重。本研究以6月龄大鼠去卵巢6个月后作为实验对象，骨质疏松敏感部位腰椎作为检测部位，对各种骨质疏松干预方法进行骨组织形态计量学评价。本实验结果显示6月龄SD大鼠在去卵巢手术后6月能较好地呈现出绝经后妇女骨质疏松的表现，从而进一步证实了去卵巢手术是复制绝经后骨质疏松实验动物模型的一个成功方法。

近来研究证实〔6～8〕，卵巢功能衰退所引起的雌激素缺乏是导致绝经后骨质疏松发生的主要原因。雌激素已成为目前治疗OP的首选药物之一。长期应用雌激素替代治疗除具有防止骨丢失和骨折的作用外，尚具有减少更年期症状、预防缺血性心脏病、预防痴呆等有益作用，但也可引起子宫出血，增加患者子宫肌瘤和乳腺癌的危险及增加深静脉血栓和肺栓塞的发生率。本实验结果显示雌激素对去卵巢大鼠骨质疏松的治疗作用是通过抑制骨转换，即同时减缓骨吸收和骨形成，但以对抗骨吸收为主，从而纠正骨代谢负平衡，减少骨量丢失，改善骨结构，最终达到保护骨的目的。超级秘书网

运动能提供力学刺激可维持或改善骨健康，有关研究显示运动能有效干预绝经后骨质疏松的形成〔9，10〕。本实验结果表明运动能有效减少大鼠去卵巢后的骨丢失，但仍不能使骨量恢复到正常对照组水平。运动对骨质疏松的治疗作用机制与雌激素治疗有明显的区别，雌激素治疗时，骨形成和骨吸收均受到抑制，以对抗骨吸收为主，而运动具有增强骨形成和抑制骨吸收的双重作用。

祖国医学将骨质疏松归于“骨痿”的范畴，中医认为肾虚、脾虚、血瘀为本症病机。中药骨康是以“肾主骨”理论为指导，针对其“多虚多瘀”之病理特点而组方的。全方以淫羊藿、肉苁蓉、补骨脂补肾壮骨为君，黄芪等健脾益气为臣，丹参等活血通络为使而组成，对绝经后骨质疏松有较好的干预作用〔11，12〕。本实验说明中药骨康能降低去卵巢大鼠的骨转换，对抗其骨质丢失，对骨质疏松有一定的治疗功效。中药骨康的治疗机制既不同于西药中抑制骨吸收药物(雌激素类)，也不同于促进骨形成的药物(氟制剂类)，而是一种对机体有整体调治功能，具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用的药物。中药对骨的双重作用与运动对骨的双重作用比较，中药治疗的促进骨形成的作用弱于运动治疗。

探索一种“复合防治方案”，即将多种防治手段有机地结合起来，使之产生多方位的放大干预效应，是目前研究的一个方向〔13，14〕。在本次实验选用的各种治疗方法中综合疗效是最明显的，但仍不能使疏松的骨质恢复到正常健康水平。本研究进行骨组织形态计量学的评价结果表明，运动和中药骨康对绝经后骨质疏松的治疗机制相似，都具有同时促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，将二者结合起来，组成运动+中药骨康联合治疗方案，能够充分发挥运动和中药骨康的治疗优势，起到协同促进的作用，可以提高疗效。运动与中药联合作用对绝经后骨质疏松有较为理想的干预效果。

【参考文献】

1章晓霜,高顺生,李青南,等.不同强度运动对去卵巢大鼠骨量的影响及机制〔J〕.中国运动医学杂志,2001;20(2):14750.

2邵敏,庄洪.含药血清对体外培养成骨细胞的影响〔J〕.中国骨质疏松杂志,2003;9(2):1179.

3唐存贵,李灵芝,金鑫,等.鼠龄对大鼠去卵巢骨质疏松模型的影响〔J〕.中国骨质疏松杂志,2008;14(4):22932.

4BedfordTC,TiptonCM,WilsonNC,etal.Maximaloxygenconsumptionofratanditschangeswithvariousexperimentalprocedures〔J〕.JApplPhysiol,1979;47:127883.

5李青南.骨质疏松实验动物研究骨组织形态计量学〔M〕.成都:四川大学出版社,2001:2348.