海藻糖的应用条件优化
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摘要：以淀粉为底物，通过麦芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）和麦芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）两种酶的共同作用生产海藻糖是一种经济高效的方法。对ArthrobacterramosusS34来源并分别在E.coliBL21(DE3)中表达的MTSase和MTHase的酶学性质进行研究，发现MTSase的最适温度为45℃，最适pH为7.0，MTHase的最适温度为55℃，最适pH为6.0。随后用2种酶共同作用生产海藻糖，优化反应条件，考查反应温度、初始pH、底物DE值、加酶量以及底物浓度等因素对酶转化过程中海藻糖产率的影响。最佳酶转化条件为反应温度45℃、初始pH5.5，底物DE值8.5，加酶量分别为MTSase最小加量15.75U/g淀粉，MTHase最小加量7.5U/g淀粉。
关键词：海藻糖；麦芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）；麦芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）；酶学性质；酶转化
海藻糖是一种在自然界中普遍存在的非还原性二糖，以稳定的α,?1,1-糖苷键连接，不能被α-葡萄糖苷酶分解[1]。海藻糖无毒，作为糖类能够为生物体提供能量和碳源。另有研究表明，当海藻糖与蛋白质、脂质、组织、器官等共存时，能够帮助它们抵抗环境压力，因此海藻糖还可用于生物物质的保存[2,3]。目前已有研究指出不同的酶系统可以有效地以麦芽糖，蔗糖和淀粉作为底物分别产生海藻糖[4-6]。1994年，有研究所发现2种不同的酶，麦芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）和麦芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）在以淀粉作为反应起始底物时，在产生海藻糖的过程中起重要作用[7]。之后，又有研究人员报道了以蔗糖为底物通过三种不同的酶（海藻糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶和葡萄糖异构酶）进行海藻糖代谢的合成[4]。1998年，经研究发现，通过海藻糖合酶可以使以α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖重组转变为以α,?1,1-糖苷键连接的海藻糖，实现以麦芽糖为底物合成海藻糖[8,9]。考虑工业应用中的成本因素，双酶法所用的底物是比蔗糖和麦芽糖更便宜的淀粉，因此以MTSase和MTHase生产海藻糖是最具成本效益的方法。在双酶法生成海藻糖的过程中，淀粉液化后，位于糊精末端的两个葡萄糖分子间的α-1,4-糖苷键可在MTSase的催化下转化为α,?1,1-糖苷键，使其变成带有一分子海藻糖的糊精。此后，经MTHase的水解作用将其水解成两部分，一部分为目标产物海藻糖分子，另一部分为减少两个葡萄糖分子的糊精，而第二部分的糊精则作为底物参与下一轮反应，继续生产海藻糖[7]。在国内外的相关研究中，已经对根瘤菌[10]，谷氨酸棒状杆菌[11]，微黄短杆菌[6]，节杆菌[12]，分支节杆菌[7]，芝田硫化叶菌[13]以及嗜热硫矿硫化叶菌[14]来源的MTSase和MTHase两种酶基因进行了克隆表达，并对两种酶的酶学性质及在生产海藻糖过程中的应用条件进行了研究。MTSase和MTHase两种酶分别由基因treY和treZ控制表达，本实验室于前期构建了分别含有treY和treZ的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treY和E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treZ，经过发酵优化，发现目的基因源自于ArthrobacterramosusS34的两株基因工程菌的发酵酶活明显高于已报道的该来源两种酶的发酵酶活，具有较高的应用价值，相关论文目前还未发表。此来源的两种酶在E.coliBL21(DE3)中的重组表达之前未有报道，因此本研究对这两种重组酶的酶学性质以及在制备海藻糖过程中的条件优化进行了研究。
1材料与方法
1.1材料与试剂，海藻糖、麦芽四糖、麦芽六糖购买于美国Sigma公司。
1.2仪器与设备，安捷伦1200高效液相色谱系统购买于美国Agilent公司。
1.3方法：
1.3.1MTSase和MTHase酶活力的测定MTSase酶活测定：10uL稀释一定倍数的MTSase酶液（空白加高温灭活的MTSase），加到190uL的10g/L的麦芽六糖溶液中（20mmol/LpH6.0的磷酸盐缓冲液配制），45℃反应10min，100℃沸水中煮10min终止反应。取100uL反应液于10mL具塞试管中，注入900uL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水补至10mL，最后在540nm波长下测定吸光度值。MTSase的酶活单位定义为：在45℃时，其他条件恒定，单位时间内每消耗1umol麦芽六糖所需的酶量。酶活公式：MTHase酶活测定：10uLMTSase浓缩酶液加到490uL10g?L-1的麦芽六糖溶液中（20mmol/LpH6.0的磷酸盐缓冲液配制），45℃反应2h，100℃沸水中煮10min终止反应。待溶液冷却后，加入10uL稀释一定倍数的MTHase酶液（空白加高温灭活的MTHase）到190uL的处理过的底物中，55℃反应10min，100℃沸水中煮10min终止反应，取100uL反应液，加入900uL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水补至10mL，最后在540nm波长下测定吸光度值。MTHase的酶活单位定义为：在55℃时，其他条件恒定，单位时间内转化生成1umol麦芽四糖所需的酶量。
1.3.2重组蛋白酶学性质的研究1.3.2.1重组MTSase和MTHase的最适温度分别将底物置于35、40、45、50、55、60、65℃等不同温度水浴中预热3min，按照1.3.1所述方法测定酶活，算出百分比。定义最高酶活为100%。1.3.2.2重组MTSase和MTHase的温度稳定性将酶液置于45℃中保温，定期取样按照1.3.1操作步骤测定残余酶活，算出百分比（设定0h酶活为100%）。1.3.2.3重组MTSase和MTHase的最适pH将酶液分别置于20mmol?L-1pH为4.0~8.0（梯度为0.5）的缓冲液中，在相应温度下预热3min，按照1.3.1所述方法测定相应pH条件下的酶活，算出百分比，定义最高酶活为100%。1.3.2.4重组MTSase和MTHase的pH稳定性将酶分别置于20mmol/LpH4.0-8.0（梯度为0.5）缓冲液中，于4℃静置24h，按照1.3.1操作步骤测定剩余酶活，算出百分比(设定0h酶活为100%)。1.3.3MTSase和MTHase制备海藻糖的工艺条件优化1.3.3.1反应温度的优化200g/L的玉米淀粉液化至DE值10，初始pH为6.0，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，30U/g底物的MTSase和MTHase在150r/min的水浴摇床中进行反应。温度分别设置为35、40、45、50、55℃，反应36h后终止反应并煮沸处理。产物稀释沉淀后用液相测定其中海藻糖含量，算出产率。1.3.3.2底物DE值的优化200g/L的玉米淀粉液化至DE值分别达到3.5、6.5、8.5和10.5，初始pH为6.0，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，30U/g的MTSase和MTHase在45℃，150r/min水浴摇床中反应36h后终止反应并煮沸处理。液相测定其中海藻糖含量，算出产率。1.3.3.3初始pH的优化200g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，30U/g的MTSase和MTHase，分别调节初始pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0在45℃，150r/min水浴摇床中反应36h后终止反应并煮沸处理。测定其中海藻糖含量，算出产率。1.3.3.4加酶量的优化200g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，初始pH为5.5，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，再分别加入终浓度为114、75.5、38、19、7.5、3.75、1.875U/g底物的MTHase和终浓度为31.5U/g底物的MTSase。另外分别加入终浓度为31.5、15.75、7.875、3.15、1.575U/g的MTSase和终浓度为114U/g底物的MTHase在45℃，150r/min水浴摇床中反应36h后终止反应并煮沸处理。液相测定其中海藻糖含量，算出产率。1.3.3.5底物含量的优化分别配置170、240、270、320g/L的玉米淀粉作为底物，液化至DE值8.5，初始pH为5.5，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，30U/g底物的MTSase和MTHase在45℃，150r/min的水浴摇床中反应36h后终止反应并煮沸处理。测定其中海藻糖含量，算出产率。
1.3.4海藻糖转化率的测定产物中的海藻糖含量采用高效液相色谱检测，NH2柱，体积分数80%的乙腈溶液，流速为0.8mL/min，柱温为40℃。1.3.5海藻糖转化率的计算1.3.6优化条件下反应过程中海藻糖产量的测定170g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，初始pH为5.5，加入5U/g淀粉的普鲁兰酶，15.75U/g底物的MTSase和7.5U/g底物的MTHase在45℃，150r/min的水浴摇床中反应。反应过程中每隔6h进行一次取样并煮沸处理，36h后终止反应。测定其中海藻糖含量，算出产率。
2结果与讨论
2.1重组MTSase和MTHase的酶学性质2.1.1重组蛋白最适温度及温度稳定性蛋白酶的催化反应速率与反应温度密切相关。如图1示，MTSase的最适温度为45℃，MTHase的最适温度为55℃。在一定温度范围内，重组MTSase和MTHase的酶活性随着温度的升高也呈现逐渐升高的趋势，由于过高的温度会使蛋白质性质发生不可逆的改变，当温度高于45℃时，MTSase的活性随着温度的升高开始降低；当温度高于55℃时，MTHase的活性开始降低。MTSase和MTHase在45℃、50℃下的稳定性结果显示在图2中。MTSase和MTHase在45℃的半衰期分别为96h和6h，在50℃的半衰期分别为50h和3h。可以看出，MTSase在45℃和50℃时具有较高的稳定性，MTHase在两种温度下的稳定性都比较差。2.1.2重组蛋白最适pH及pH稳定性酶反应的反应速率会受到环境pH的影响。如图3所示，MTSase在pH值5.5~8.0的范围内均有70%以上的酶活，并在pH7.0的环境下，测得的酶活最高，大于或小于7.0的pH环境都会使酶活逐渐降低。MTHase的最适pH为6.0，在大于6.0的pH环境下，MTHase的活性急速降低，如当pH为6.5时，酶活相对值迅速降低至57.9%；而在小于6.0大于5.0的pH时，MTHase的酶活能够稳定在一定的范围，达到酶活相对值85%以上；在更低的pH（<5.0）时，MTHase的酶活相对值则急速降低到42%以下。综上，重组MTHase适合的pH范围应为5.0~6.0。另外，pH稳定性结果（图4）表明，在4℃时，MTSase和MTHase在pH4.0~8.0均能保证较好的稳定性。
2.2重组MTSase和重组MTHase制备海藻糖的工艺条件
2.2.1反应温度与海藻糖转化率的关系温度会使酶的酶活性大小以及酶的稳定性发生改变，从而改变海藻糖的产率。如图5所示，在反应温度逐渐升高时，海藻糖的转化率也随着提高，并在45℃时到达最高值，为54.2%。但在45℃之后，海藻糖的转化率随着温度的升高快速下降，这可能是高温使得MTHase快速失活而导致的。综合以上因素，最终选择45℃作为转化产海藻糖的反应温度。
2.2.2底物液化DE值与海藻糖转化率的关系底物玉米淀粉液化结束时的DE值会对与海藻糖的转化率之间也有着密切的联系。如图6所示，海藻糖的转化率随着DE值的升高而增加，并在DE值为8.5时达到最大值56.8%。这可能是因为在DE值过低时，糊化过的淀粉底物在温度自然下降的过程中更易发生老化，使得淀粉内部已被破坏的分子氢键再次结合，随着部分分子的有序排列，即造成结晶沉淀，从而使得底物利用率大大降低[15]。而当底物DE值达到8.5时，更高的DE值代表着更低的聚合度，由于MTSase和MTHase在反应过程中只会对聚合度≧3的糖链起作用[7]，因此在一定范围内，底物转化成海藻糖的转化率会随着淀粉底物聚合度的降低而减少，因此，在DE值为8.5时，最适合进行底物制备海藻糖的反应。
2.2.3初始pH与海藻糖转化率的关系由图7可以看出，重组MTSase和重组MTHase转化底物生成海藻糖的最适初始pH为5.5。初始pH低于5.5或过高时，海藻糖转化率显著降低，很可能是一方面过高或过低的pH使得酶活性中心的构象发生改变，甚至改变了酶分子的整体结构使其变形失活，导致酶分子的稳定性大大降低；另一方面可能是不同pH会对酶活性中心附近相关基团的解离状态产生一定的影响，造成活性部位与底物结合难易度的区别[16]。当初始pH处于5.5~6.5之间时，海藻糖转化率也逐渐减少，可能是因为在该pH范围内，不同pH导致酶稳定性的变化，而这种变化对海藻糖产率的影响高于酶最适pH对其的影响。综上考虑，选择5.5作为反应的初始pH。
2.2.4加酶量与海藻糖转化率的关系加酶量是影响海藻糖转化率的重要因素，由于海藻糖的转化需要MTSase和MTHase的共同作用，因此对两种酶的加量进行了研究。如图8所示，在加酶量充足的情况下，两种酶的加量比例对海藻糖的转化率没有明显的影响。在转化过程中，如要保证一定的海藻糖转化率，两种酶都有对应的最少加量。如图8（a），加入足量恒定的MTHase时，控制MTSase的加量，当其降低到15.75U/g时，依然能够保持65%以上的转化率，而当MTSase的加量降低到7.875U/g时，海藻糖转化率则直接降低到55%。如图8（b），加入足量恒定的MTSase时，控制MTHase的加量，在其加量≧7.5U/g时，海藻糖转化率可始终稳定在63%以上。因此，在酶转化产海藻糖过程中，MTSase和MTHase的最少加量分别为15.75U/g和7.5U/g。
2.2.5底物浓度与海藻糖转化率的关系为了提高工业生产中制备海藻糖的效率，研究了底物浓度对两种酶共同作用生成海藻糖的转化率的影响，分别在17%、24%、27%、32%四个不同的底物浓度下对其进行研究。结果（图9）显示，更高的底物浓度会伴随有更低的海藻糖转化率，其转化率最高点在底物浓度为17%时达到，为67.7%。虽然海藻糖转化率随着底物浓度的升高而逐渐降低，但考虑到工业生产中进行一批生产所需的人力物力是一定的，因此在具体生产过程中，应对总体成本进行核算，以选取最佳底物浓度。
2.2.6优化条件下海藻糖产量的过程研究经条件优化后得知，MTHase和MTSase协同作用产海藻糖在45℃时能达到最高的产率。考虑到MTHase在45℃时的半衰期为6h，因此在45℃下对海藻糖转化进行过程研究。同时，作为对照，在反应进行到12h时，向反应体系中补加终浓度为7.5U/g底物的MTHase，继续反应至36h。结果（图10）表明，补加MTHase对海藻糖最终的转化率没有明显提高。主要的转化过程在前24h完成，在24h到30h的时间里，海藻糖含量的增速降低，但依然在增加，直到转化进行到30h~36h之间时，海藻糖含量开始稳定。这表明在整个反应过程中，MTHase均有着合适的酶活性来保证反应的进行，分析原因可能是当酶液与底物共同存在时，底物对MTHase具有保护作用。
3结论
本研究中重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treY和E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treZ能够分别高效表达MTHase和MTSase，经研究发现，MTSase的最适温度为45℃，最适pH为7.0，MTHase的最适温度为55℃，最适pH为6.0。在两种酶的产海藻糖应用研究中发现其最适转化温度和pH为45℃、初始pH5.5，这与其酶学性质研究结果相对应。另外，其最适底物DE值为8.5，过高和过低的DE值对其转化率的影响都较大，因此后期在实际工厂生产中应严格控制底物淀粉的液化时间，以使其DE值达到8.5左右，保证海藻糖转化率。在反应过程中，MTSase和MTHase最小加量分别为15.75U/g淀粉和7.5U/g淀粉，并且过量的两种酶对海藻糖的转化率都没有明显的影响。因此，在生产过程中，可以适当的增加MTSase和MTHase两种酶的加量，保证反应的正常进行。最后，底物浓度对反应的进行也有着较大的影响，在其他条件恒定时，转化率在一定范围内随着底物浓度的升高而降低。同时考虑到生产过程中的成本问题，应当结合具体情况，全面考虑以选择最优的底物浓度。综上，本研究对两种重组酶在海藻糖的生产中的应用，具有一定的指导作用。
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作者：王魁1，2宿玲恰1，2吴敬1，2陈晟1，2* 单位：1江南大学,食品科学与技术国家重点实验室2,生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室
