克隆技术范文精选

新世纪伊始，人类社会步入了快速发展和剧烈变动之中。在这一系列的发展变动之中，克隆技术备受关注，日渐成为人们生活中的一个重要名词。一方面，由于克隆技术给人类生活带来的美好前景，人们对它寄予了无限的期望；而另一方面，又由于其可能给人类社会造成不确定的抑或是灾难性的后果，不少人视之为洪水猛兽而强烈反对。2004年11月19日联合国一次会议放弃了制定一项禁止生殖性克隆人的国际条约的努力。在这次大会上，由于争论陷入僵局，由哥斯达黎加等60国提出的要求全面禁止克隆人试验的提议，和由比利时提出的禁止生殖性克隆人研究、允许治疗性克隆研究的提议均未通过。克隆技术目前发展状况如何？克隆人究竟离我们有多远？克隆技术产生了哪些伦理问题？克隆技术可以禁止吗？伦理学不能接纳这项新技术吗？我们应该怎样对待克隆技术的发展？本文拟就这些问题进行一些讨论。

一、克隆技术的发展使克隆人成为可能

上世纪初，韦伯（H.J.Webber）创造了“克隆”这一词，其含义指由单个祖先个体经过无性繁殖而产生的其他个体。由于该词构词简短，容易发音，能清晰表达出准确的意思，因此这一术语很快得到学术界的认同并加以广泛使用[1](P.160)。1952年，科学家开始用青蛙进行克隆实验。从此以后，动物克隆的试验结果不断涌现。1970年克隆青蛙实验取得突破，青蛙卵发育成了蝌蚪。1984年第一只胚胎克隆羊诞生。1997年2月24日，英国罗斯林研究所的科学家用取自一只6岁成年羊的乳腺细胞培育成功一只克隆羊。1998年7月，日本科学家利用成年动物体细胞克隆的两头牛犊诞生。2000年1月，美国科学家宣布克隆猴成功。2000年3月14日，曾参与克隆小羊“多莉”的英国PPL公司宣布，他们成功培育出5头克隆猪。

随着一系列克隆技术突破的完成，克隆人从技术上来讲已成为可能。有的科学家认为，从技术上说克隆人并不比克隆其他哺乳动物更困难。克隆人即将出世的消息也不断传来。意大利著名的“克隆狂”安蒂诺里曾宣布，克隆胎儿将于2003年1月问世。2003年第一期《发现》杂志也把2002年“命名”为“克隆年”，理由是克隆技术在当时已经进入了克隆人的阶段。该杂志断言：“虽然世界不想要克隆人，但克隆人却将要出现。”

但是至今我们没有见到克隆人的问世，原因是尽管克隆技术出现了长足的进步，但是仍然存在着一些目前尚没有解决的问题。在理论上，分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄，克隆动物的连续后代是否会累积突变基因，以及在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在实践中，存在着低着床率、高流产率的问题，维尔穆特研究组在培育“多莉”的实验中，融合了277枚移植核的卵细胞，仅获得了“多莉”这一只成活羔羊，成功率只有0.36％，同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有1.7％和1.1％。此外，生出的许多个体表现出生理缺陷或畸形。以克隆牛为例，日本、法国等国培育的许多克隆牛在降生后两个月内死去[2]。观察结果表明，部分牛犊胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长因子的浓度都低于正常水平；有些牛犊的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常发育；克隆动物胎儿普遍存在比一般动物发育快的倾向，这些都可能是死亡的原因。

虽然存在各种各样的问题，但几年来克隆技术的发展表明，世界各科技大国都不甘落后，谁也没有放弃克隆技术研究。同时，克隆人的出现越来越成为可能，人们对其可能产生的伦理问题表现出了空前的担心。

1材料与方法

基因DNA模板、PCMV阳性血清、表达载体pET32a（＋）均由四川农业大学动物生物技术中心提供，2月龄健康雄性白兔（体重2kg）购自雅安市某家兔养殖基地。克隆载体pMD19－TSimple，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA连接酶、IPTG、蛋白质Marker购自大连宝生物工程有限公司；、质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、购自北京天根生化科技有限公司；N，N’－亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、SDS、TEMED、考马斯亮蓝R－250、2－巯基乙醇、溴酚蓝、琼脂糖、甘油、氨苄青霉素、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、硫酸铵等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他化学试剂均为分析纯。引物的设计与合成应用．0b等分子生物信息软件对PCMVgB基因及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析，并选择gB基因2305～2574bp优势抗原表位区作为目的序列，参照NCBI上的猪巨细胞病毒gB基因序列（登录号：FJ844360．1），应用Oligo7．0软件设计引物P1、P2，在引物P1、P2的5′端分别引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ，用于PCR产物与表达载体的连接，并在引物P1、P2酶切位点后分别引入起始密码子ATG和终止密码子TAG。P1／P2扩增的目的片段长270bp，上述引物送上海Invitrogen生物技术有限公司合成，引物序列如下（下划线处为EcoRⅠ酶切位点），下划线处为HindⅢ酶切位点）。PCMVgB基因优势抗原表位区的PCR扩增以gB基因DNA为模板，分别以P1、P2为上游引物和下游引物，对PCMVgB基因优势抗原表位区进行体外扩增。PCR反应的程序为：94℃预变性，经30个循环后，于72℃延伸8min。基因优势抗原表位区表达载体的建立及重组蛋白的表达与纯化将PCR产物于琼脂糖凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段，将目的片段连入pMD19－TSimple克隆载体并转化入E．coliDH5α后抽提质粒，进行质粒基因组测序，并使用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切，将酶切后的目的片段连接入pET32a（＋）载体，并命名重组质粒为pET32a（＋）－gB，转化入E．后将重组表达菌命名为E．。使用浓度为0．2mg／L的IPTG诱导E．重组表达菌表达后，将表达产物通过组氨酸标签融合蛋白纯化柱进行纯化，并测定纯化后的蛋白质浓度。PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白的反应原性分析以纯化的PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白作为抗原，PCMV阳性血清为一抗，以HRP标记的羊抗猪IgG为二抗进行试验，并设置PCMV阴性血清对照组，鉴定PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白的反应原性。多克隆抗体的制备及抗体效价的测定使用纯化后的PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白与弗氏佐剂按1∶1体积比进行乳化后制成油乳剂，对健康家兔进行免疫，第4次免疫完成后对试验家兔采取心血，将血液收集至离心管中，先于常温倾斜放置30min，再转至37℃培养箱中放置1h，最后转入4℃冰箱中放置过夜，于4000r／min离心15min分离血清。将分离的血清无菌进行分装后于－20℃保存备用，并避免反复冻融。以纯化后的PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白（质量浓度为0．62μg／mL）作为抗原，以琼脂扩散试验验证经PBS缓冲液稀释后的多克隆抗体效价。鉴定以纯化的PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白作为抗原，制备的多克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western－blot鉴定，以免疫前的家兔血清作为阴性对照，鉴定该多克隆抗体的反应性。

2讨论

自1950年PCMV在英国被发现以来，该病毒就因为其免疫抑制特性以及能够通过跨物种器官移植而感染人与其他动物而备受关注，但由于该病毒分离困难，导致了对该病毒的研究一直落后于其他疱疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B（gB）是PCMV重要的跨膜糖蛋白，也是特定细胞毒T淋巴细胞的主要靶蛋白，是淋巴因子激活的自然杀伤细胞的识别对象，且gB蛋白具有良好的免疫原性，并在诱导机体体液免疫和细胞免疫中起着重要作用，对该蛋白进行研究有助于了解PCMV的感染机制，为该病毒感染的防治奠定了基础。本试验构建了pET32a（＋）－gB高效重组表达质粒，应用原核表达系统以可溶性形式高效表达了PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白，成功表达并纯化了PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白，并验证了其具有良好的反应原性，可以作为间接ELISA检测的包被抗原，通过琼脂扩散试验和Western－blot试验，也证实了制备的多克隆抗体可以与gB蛋白特异性结合。本研究为进一步分析PCMVgB蛋白的生物学特性，建立PCMV抗体血清学诊断方法奠定了重要基础，为制备早期检测PCMV抗体的检测试剂盒奠定了基础。

作者：江一帆刘骁单位：四川农业大学

一电路设计与实现

国内已有的研究文献，只是对仲裁器PUF进行了改进，但并没有提高仲裁器PUF在不同芯片中的差异性以及系统的稳定性，也未对具体的应用进行描述。对此，本文设计了由多路仲裁器PUF电路、多数表决器和运算门阵列三部分组成的防克隆电路，用以解决上述问题。

1多路仲裁器PUF电路设计

仲裁器使用D触发器，D触发器不易进入亚稳态。即使信号传输的延时差小于D触发器建立时间，它的输出也是一个稳定的状态，不是‘1’就是‘0’。但根据以往研究者的资料和实际实验测试，使用了D触发器的仲裁器PUF存在以下的问题:相同电路在不同芯片间的传输延时差异性减小，张俊钦等人测得该差异产生的概率约为11.2%;针对此问题，文中共设计了8支仲裁器PUF电路。每支仲裁器PUF由128个开关单元组成，结构完全一致，但选择位F(0．．．127)不同。左半部分为8支仲裁器PUF，右半部分为其中一支仲裁器PUF的局部放大图。F［0］～F［10］为一部分选择位，“信号输入”代表仲裁器PUF的输入端，“信号输出”代表仲裁器PUF的输出端。每一支仲裁器PUF电路都通过运算门阵列与被保护电路的输出进行运算。因此，只要有一支电路的延时差发生差异，最终的输出都会发生变化。而最终的输出发生变化的概率，即8支电路中至少有一支在不同芯片中产生延时差异的概率为1－1－0．()1128=61.34%。理论上，PUF的数量越多，上述的概率就越高，但考虑到FPGA资源有限，过多的PUF电路会占用过多的空间，因此只设计了8支电路，而此概率已远远高于D.Lim等人得到的23%的概率。在设计中，通过分析不同的选择位对应的响应，确定每支PUF电路的选择位，使得输出结果中，各有4支电路的输出为‘1’和‘0’，保持了‘1’和‘0’的均衡性，从而加大敌方破解的难度。经过实验，使用8支电路达到了预期的效果。此外，仲裁器PUF的输出取决于上下两条线路的延时差，而电路的布局布线对延时有很大的影响。每次进行重新编译时，布局布线都有可能发生改变，导致延时差发生变化，从而引起输出的改变。同时，即使在同一块芯片中，也可能存在着工艺不均匀的情况，所以仲裁器PUF布局在不同的位置，就可能会产生不同的输出。考虑到这点，在实际操作中，本文使用了Altera公司QuartusII的高级功能逻辑锁(LogicLock)，将设计好的仲裁器PUF电路锁定在了芯片的固定区域内，减小了布局布线及芯片不均匀产生的影响，同时给被保护电路的设计留出了足够的芯片资源，使得两者不会产生干扰，还有利于团队的分工和协作，提高效率。

2多数表决器为保证系统稳定

要求仲裁器PUF在同一芯片中对同一激励的响应保持恒定。在实际应用中，气温变化与电压不稳是电子设备面临的两个最大难题，仲裁器PUF也不能例外。尽管D.Lim等人测得仲裁器PUF在同一芯片中对同一激励的响应发生变化的概率只有0.7%，但该数据是在温度范围为40～70℃，电压变化幅度为±2%的情况下测得的。若电子设备要求必须能在极端环境下正常工作，上述测试环境下的数据显然不能满足要求。因此必须进行电路设计，保证输出的稳定性。借鉴文献提到的方法，对每一支仲裁器PUF在同一激励下的多次响应进行寄存，然后对寄存的响应进行多数表决。由此可以有效避免因外部环境变化而对输出产生的影响。其中多数表决器由VHDL写成，并生成符号(symbol)，与仲裁器PUF在原理图环境中进行编译，

1材料与方法

下游引物P，下划线处分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。L基因的克隆与鉴定以绵羊痘病毒基因组DNA为模板，采用50μL体系进行PCR扩增。将纯化的PCR产物与mple克隆载体连接，并将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定，并测序。绵羊痘病毒E3蛋白的生物信息学分析将测序结果应用NCBI数据库ORFfinder程序推导出相应的氨基酸序列，并应用Weblab服务器中法对SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列进行比对。二级结构、蛋白质柔性区域分析分别使用软件的法和法进行预测。蛋白中氨基末端和羧基末端2个功能域的三级结构使用SWI服务器进行预测。重组载体的构建及重组蛋白的诱导表达、纯化E3L重组载体和表达载体pGEX4T－1分别用酶切后，经琼脂糖凝胶电泳检测后用凝胶回收试剂盒回收目的条带，16℃连接过夜，并转化至DH5α感受态细胞。毒株绵羊痘病毒古浪株由中国农业科学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室分子免疫与环境控制课题组分离、鉴定和保存。主要试剂TaqDNA聚合酶、载体、大肠杆菌菌株连接酶、限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自大连宝生物工程有限公司；pGEX4T－1表达载体表达菌、GST结合树脂和硝酸纤维素膜购自公司；氨苄青霉素、IPTG、弗氏佐剂和辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗山羊IgG购自Sigma公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自公司；化学发光底物购自公司；X光底片、显影及定影液均购自柯达公司；其他试剂均为进口分析纯。引物的设计与合成根据GenBank中登录号为的基因组序列，利用软件设计了1对引物，预期扩增产物的大小为534bp。上游引物P，挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定，并测序。将鉴定正确的重组载体转化至BL21（DE3）pLysS感受态细胞，37℃振荡培养至时，加入IPTG至终浓度为1mmol／L诱导培养离心10min收集菌体，处理后进行检测。用裂解缓冲液重悬诱导表达的菌体，在冰浴条件下进行超声破碎（超声5s，停8s）至溶液澄清，离心，分别取上清和沉淀进行SDS－PAGE，分析重组蛋白SPPVE3的可溶性。重组蛋白使用Novagen公司的GST结合树脂进行纯化。重组蛋白鼠抗血清的制备及分析选取周龄的BALB／c小鼠进行免疫：初次免疫时，用纯化后的重组蛋白SPPVE3与等量弗氏完全佐剂混合，经乳化后皮下多点注射；第14天，用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合，乳化后加强免疫。二免后第14天采血，分离血清，用纯化的重组蛋白SPPVE3包被ELISA板，进行间接ELISA试验，测定血清效价。

2SPPVE3L基因的序列分析与结构预测经测序分析

SPPVE3L基因全长534bp，编码177位氨基酸，分子质量约为。使用法分析，基因与VVE3L基因的核苷酸序列具有50．8％的一致性，在氨基酸水平上具有34．9％的一致性（50．0％的相似性。从功能结构域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列与E3蛋白ZDBD相比具有28．2％的一致性（47．4％的相似性），而羧基末端与DRBD相比具有41．9％的一致性（52．7％的相似性）使用法预测蛋白的二级结构，发现α－螺旋主要存在于位氨基酸；β－折叠主要分布于位氨基酸；利用法预测蛋白质柔性，结果表明较大的柔性区域分布于位氨基酸。根蛋白结构预测服务器，对SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2个潜在的功能结构域氨基酸序列进行蛋白三级结构的同源建模。构建的氨基酸区域分别为3～71和102～173位氨基酸，参考模板分别为E3蛋白的Z－DNA结合域和PKR的dsRNA结合域。序列一致性分别为40．58％和26．027％，E值分别为E－21和1．8E－16，表明模型构建可靠。重组质粒的鉴定及重组蛋白的诱导表达与纯化经酶切鉴定（见图6）及测序鉴定，表明E3L重组载体构建正确。含有重组载体的BL21（DE3）pLysS重组菌在浓度为1mmol／L条件下诱导4h后，经E电泳分析，显示在46ku处表达出一条明显的条带，分子质量与预期大小一致。经可溶性分析，表明重组蛋白主要以可溶形式存在于菌体中，经GST结合琼脂可纯化出目的条带重组蛋白SPPVE3鼠抗血清的制备分析用绵羊痘病毒标准阳性血清和制备的鼠抗血清对SPPVE3蛋白进行分析，结果显示所制备的鼠抗血清可以与重组蛋白发生反应。对制备的重组蛋白SPPVE3鼠抗血清进行间接ELISA检测，其效价为。

3讨论

蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子，主要由位于氨基酸末端的ZDBD和羧基末端的DRBD两个关键的功能结构域组成。其中，E3蛋白的羧基末端能够通过其dsRNA结合域阻断病毒复制周期中产生的dsRNA，抑制了Toll样受体、人视黄酸诱导基因／RIG样受体以及细胞内PKR和OAS等各类抗病毒信号通路和抗病毒分子的活性，病毒得以正常复制。目前，除了VV外，E3蛋白的同源蛋白在羊口疮病毒（ORFV）中已进行了较为深入的研究，结果显示在体外细胞试验中，ORFVE3蛋白取代VVE3蛋白后构建的重组病毒VV／ORFVE3与野生型VV致病性并无明显差别，但在动物试验中，的致病性显著降低。等报道SPPV基因组的第34号开放阅读框编码VVE3蛋白的同源蛋白，表明SPPV可能编码类似VVE3蛋白的免疫逃避因子。SPPV主要引起感染绵羊全身皮肤（特别是身体无毛部分）出现典型的痘疮，造成家畜产奶量下降、体重减轻、流产率增加以及对肺炎和皮毛蝇蛆病的易感性增加，同时也会造成直接死亡。本试验中，笔者以绵羊痘病毒甘肃古浪株为模板克隆出绵羊痘病毒E3L同源基因，基因全长534bp，编码177个氨基酸。经过序列比对，SPPVE3蛋白与VVE3蛋白核苷酸序列的一致性达到50．8％，而氨基酸序列一致性为34．9％（相似性为50．0％）。从功能结构域角度分析，SPPVE3蛋白与VVE3蛋白ZDBD的一致性只有28．2％（相似性为47．4％）；而DRBD一致性虽然高达41．9％（相似性为52．7％），但在决定dsRNA结合活性的和A174氨基酸残基中，第174位氨基酸残基中A→S的突变可能使其dsRNA结合活性大大降低，推测SPPVE3蛋白对干扰素的抑制效应将会减弱。在本研究中，以pGEX4T－1为载体，表达出大小为46ku左右的重组蛋白。利用纯化后的重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得鼠抗血清，经间接ELISA测定效价为。利用制备的抗体能够分析SPPV在感染细胞后E3蛋白的表达情况以及对PKR等抗病毒分子的影响，为阐明羊痘病毒的致病机理奠定了基础。

1材料和方法

蛹期开始将雌雄分开饲养，羽化后喂以5%的蜂蜜水。养虫室温度为26℃，相对湿度为70%～80%，光周期16D∶8L。总RNA的提取及cDNA第一链的合成为测定气味结合蛋白基因的组织表达谱，取3龄幼虫头部和去除头部的剩余组织，取3日龄雌雄成虫的不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅)，其中，雄虫触角收取30对，雌虫触角收取40对，其他组织适量，重复3次。组织收取后立即放入液氮中，－70℃保存备用。按照说明书，用SVTotalRNAIsolationSystem提取总RNA，然后用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，－20℃保存备用。RACE扩增利用本研究组委托深圳华大科技有限公司测得的二化螟基因组数据，与GenBank中的OBP序列进行比对得到CsupOBP1基因的cDN段。根据片段序列，设计合成5''''GSP和3''''GSP引物。依据扩增试剂盒操作说明，进行RACEcDNA第一链的合成及PCR扩增。PCR产物用1．5%琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带经AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收后，连接到pEASYTM-T3载体上，然后转化到Trans1-T1感受态细胞中。转化后的菌落经蓝白斑筛选，挑取单个白色菌落放入含有0．1%Amp的LB培养液中，在250r/min、37℃下震荡培养12～16h后，采用质粒提取试剂盒(Omega，USA)提取质粒，送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

2序列分析

测定为了明确二化螟OBP1基因的组织表达谱，利用ABI7500Real-timePCRSystem进行了相对表达量测定。内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因和转录延长因子4(E2F)基因，用于实时荧光定量PCR的引物序列。RT-qPCR反应体系为模板2．0μL，超纯水补足至20μL。采用两步法标准程序进行扩增:95℃预变性30s;95℃5s，60℃34s，共40个循环。反应后进行溶解曲线分析，以排除非特异性PCR产物的污染，空白对照模板以超纯水代替cDNA。蛋白的原核表达与纯化根据二化螟OBP1阅读框序列及表达载体pET-30a(+)设计带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点(以下划线标示)的引物序列。以成虫触角cDNA为模板，采用高保真性和高扩增效率的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，按照PrimeSTAR说明书进行PCR扩增。将PCR产物回收，再连接到pEASYTM-T3载体中并转化到Trans1-T1感受态细胞中，提取质粒DNA并测序验证。将含有目的片段的重组质粒DNA和pET-30a(+)质粒DNA分别进行双酶切，然后将目的片段连接到pET-30a(+)载体，再转化到Trans1-T1感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的LB平板进行筛选，挑取阳性克隆，小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞中，涂板培养后挑取单菌落接种于5mLLB培养液(含Kan50μg/mL)中，37℃振荡培养过夜。次日，将所得菌液按1/100(v/v)的比例接种于新鲜的LB培养液(含Kan50μg/mL)中，37℃振荡培养，当细胞生长至OD600=0．6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，37℃下250r/min振荡培养5h。将菌液8000×g离心20min后收集沉淀(菌体)，加入预冷的Resuspensionbuffer(20mmol/LTris-HCl，0．5mmol/LNaCl，pH7．将沉淀重新悬浮，超声破碎后用12000×g离心15min，分别收集上清及沉淀，用SDS-PAGE检测重组蛋白是否为可溶性蛋白。重组蛋白的纯化使用装有填料的亲和层析柱XK16/20，对纯化后的重组蛋白进行肠激酶酶切以切除His-tag标签，酶切后的重组蛋白再次过亲和层析柱。纯化后的目的蛋白经过透析(除盐)、冷冻干燥后，保存于－70℃备用。

3荧光竞争结合实验

缓冲液中，配成蛋白溶液，测定浓度。荧光探针1-NPN和气味物质(植物挥发性化合物，见表2)溶于甲醇中，使其终浓度为1mmol/L，作为工作液。以1-NPN为探针，利用荧光竞争结合实验测定气味物质和OBP间的亲和力已有很多报道(Zhouetal．，2004b;Heetal．，2011;Qiaoetal．，2011;孙红岩等，2011;LiuNYetal．，2012;LiuSJetal．，2012;张婷等，2012;Lietal．，2013)。首先测定CsupOBP1与1-NPN的结合曲线。将蛋白溶液加入20mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，使其终浓度为2μmol/L，按和20μmol/L的浓度梯度加入1-NPN，每次加入后反应2min，在337nm激发，记录荧光发射情况，利用其荧光值计算出该蛋白与1-NPN的结合常数，然后利用竞争结合实验测定气味物质和蛋白的结合能力。在竞争结合实验中，蛋白和1-NPN的浓度均为2μmol/L，反应时间为2min，在337nm激发，记录荧光值(初始荧光值)。然后将被测气味物质按终浓度和20μmol/L的浓度梯度加入到1-NPN和蛋白的混合液中，每次加入后反应2min，记录荧光值。对于浓度在20μmol/L时相对荧光值降到60%以下的气味物质，再进行2次重复试验，以3次重复计算有关参数;对于结合能力较低的气味物质，第一次测定后不再进行重复试验。计算荧光值降低到初始荧光值一半时气味物质的浓度，即IC50值，利用公式Ki=IC50/(1+［1-NPN］/K1-NPN)计算各气味物质的结合常数，其中［1-NPN］为未结合的1-NPN浓度，K1-NPN为1-NPN与二化螟OBP1的结合常数(Banetal．，2003)。