探究酵母菌克隆的制备方法

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1方法

白假丝酵母菌总DNA提取将白假丝酵母菌SC5314株接种于马铃薯斜面培养基，37℃孵育48h，挑选数个大的、新鲜培养的克隆，通过玻璃珠法提取白假丝酵母菌总DNA。聚合酶链反应（PCR）扩增SAP2目的片段查找GenBank中白假丝酵母菌SC5314株的SAP2核苷酸序列根据SAP2的编码序列和原核表达载体pMAL－c2x序列的酶切位点设计引物，上游引物：下游引物：划线部分为EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点，斜体部分为保护性碱基）。以白假丝酵母菌SC5314的全基因组DNA为模板，根据以上引物，利用合成酶进行PCR扩增，获得SAP2目的片段（169～1194bp）。PCR条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃贮存PCR产物。采用柱式胶回收，PCR产物纯化试剂盒回收及纯化SAP2目的片段。质粒的构建及鉴定将含有pMAL－c2x的E接种至液体培养基中于37℃剧烈振摇（200r／min）培养过夜增菌，用SDS碱裂解法提取质粒DNA。将纯化的SAP2基因片段与原核表达质粒pMAL－c2x在37℃下经过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切2h。双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下收取双酶切目的片段及质粒，用DNA片段玻璃奶快速回收至纯化试剂盒纯化双酶切产物。按载体DNA与插入DNA片段的比例估算出连接中各自DNA加入的量，在T4DNA连接酶的作用下，充分混匀，16℃过夜连接，连接产物4℃保存。用CaCl2法制备并转化感受态细胞，挑选阳性克隆菌提质粒，进行酶切鉴定和测序分析。少量IPTG诱导表达将重组原核表达载体转化感受态细胞挑取单菌落至3mLAmprLB培养基中，蔗糖37℃剧烈振荡过夜培养，次日分别取150μL过夜培养菌液转接于2支含5mLAmprLB培养基的试管中，37℃振荡继续培养0．8时，向其中一支试管中加入IPTG至终浓度，以16℃继续诱导培养14h，同时设不加IPTG诱·242·中国感染控制杂志2013年7月第12卷第4期导的菌液为对照组。4000r／min离心10min收集菌体沉淀，重悬于1mL的PBS中，诱导组利用超声破碎仪破菌，并在，4℃离心样品20min，留取诱导上清及诱导沉淀样品。最后取10μL留取的样品，加入中，混匀后煮沸20min，冷却后离心，采用SDS－PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况。大量诱导表达目的蛋白按照试表达的条件扩大培养基至1L，其余条件同上。目的蛋白纯化从4℃冷柜中取出装入的层析柱中，自然沉降后装好柱头，利用平衡缓冲液，平衡约9个柱体积，超声破碎后离心上清上柱，控制流速1mL／min，流穿样品收集后再次上柱，重复3次，以确保蛋白与层析柱充分结合。用平衡缓冲液冲洗纯化柱约12个柱体积，至检测不到蛋白洗出为止。取出介质（10mL）装入50mL离心管中，加入300μLXa因子封好管口后，置于静音螺旋混合仪上，4℃混合过夜酶切。酶切后的介质重新装柱，收集流穿，再用平衡缓冲液冲洗约2个柱体积收集流穿液，即为酶切后目的蛋白。

2鼠抗血清制备

取可溶性Sap2蛋白用PBS稀释后配制成0．5mg／mL溶液，初次免疫时，将等量rSap2和弗氏完全佐剂各500μL混合后充分乳化。选取9只6周龄BLAB／c小鼠，经左／右侧后肢胫前肌注射rSap2蛋白，初次免疫剂量为每只50μg。初次免疫后第14、21、28d加强免疫，免疫剂量为每只25μg，共加强免疫3次。加强免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混匀，方法同上。末次免疫后7d采尾静脉血L，并以离心5min，获取血清约30～50μL，采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）测定效价。间接ELISA法测定抗血清效价用包被缓冲液将rSap2稀释至终浓度5μg／mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜。PBST洗板3次，加孔封闭液，37℃封闭洗板3次，将抗血清倍比稀释，稀释比例依次为51200，每孔100μL，37℃孵育1h。同时用PBS作空白对照，正常小鼠血清作阴性对照。洗板4次。取辣根酶标记的羊抗鼠IgG按稀释后，每孔孵育30min，涤4次。每孔加入100μLTMB底物缓冲液，37℃显色15min后，每孔加入50μL终止液将酶标板放入酶标仪，以450nm单波长测定各孔OD值，以1倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为抗血清ELISA效价。抗血清的纯化将抗血清用PBS稀释4倍，0．45μm微孔滤膜过滤备用。准备亲和层析填料，装入层析柱，利用10倍于床体积并经过预冷的PBS缓冲溶液平衡亲和柱至基线平稳，将流速调整为，并将预装柱与蠕动泵和检测仪、记录仪连接好，注意避免气泡进入。按1mL／min流速，将抗血清样品上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。加入2倍柱体积的pH2．7甘氨酸洗脱液洗脱，夹住流出管，静置5min后收集洗脱液，重复3次。之后立即加入的中和缓冲液，使其pH值接近7．0。用结合液冲洗柱子至pH值与结合液相同，再用PBS平衡至基线。用BCA法测定纯化后多克隆抗体的浓度。1．2．9鼠抗rSap2多克隆抗体的特异性鉴定将可溶性Sap2蛋白上样5μg行SDS－PAGE电泳，转膜后将抗Sap2多克隆抗体1∶高灵敏度化学发光检测试剂盒显色，行免疫印迹）分析。

3结果

目的片段PCR扩增SAP2目的片段，1％琼脂糖凝胶电泳显示，在约处有一清晰条带，与预期分子量大小一致。重组载体的酶切鉴定结果酶切后，质粒DNA在凝胶上出现一条与质粒大小相符的条带和一条与SAP2基因片段大小相符的条带。以上，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，显色呈阴性，表明rSap2蛋白免疫小鼠产生了较高滴度的抗体。

作者：仇萌邹先彪李蕾单位：中国人民解放军总医院