探析白丝球的克隆技术及方法

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1重组载体的测序结果

将重组载体pMAL－c2x／SAP2送至公司测序，测序结果与GenBank中白球丝标准株SC5314的SAP2基因序列进行同源性对比，发现1处发生碱基置换，即468位A→T，但编码的氨基酸相同，且SAP2基因插入的方向正确，保证了氨基酸序列的编码正确性，表明重组质粒构建成功。

2重组载体pMAL－c2x／SAP2的可溶性表达

转入E．coliBL21（DE3）的pMAL－c2x／SAP2在16℃下经IPTG诱导14h表达出目的蛋白，通过SDS－PAGE电泳分析目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在，表达量约占总蛋白的10％，沉淀占总表达量的10％。目的蛋白纯化将诱导表达的蛋白超声破碎后，用淀粉树脂对其亲和层析纯化及蛋白酶切后，结果显示，41kD处有一明显条带，蛋白纯度＞90％。。抗血清的效价检测通过间接ELISA法检测抗体，其滴度值见，滴度曲线见。效价达到抗血清的纯化将抗血清进行ProteinG亲和层析纯化后行SDS－PAGE电泳检测，25kD和55kD处可见2条清晰的条带，即抗体的轻链和重链，无杂蛋白带出现。纯化后的抗体经BCA法测定浓度为1．5mg／mL。2．8WesternBlot分析多克隆抗体的特异性经WesternBlot分析，多克隆抗体能与Sap2蛋白特异性结合，在分子量约为41kD处有蛋白杂交带。

3讨论

白球丝毒力因子包括其黏附性、菌丝形成、表型转换及胞外水解酶等。胞外水解酶中的Sap与白球丝的致病性密切相关，可水解宿主细胞的膜蛋白，通过黏附、入侵组织破坏宿主的防御系统来避免或抵御杀菌剂的进攻。本研究从白球丝标准菌株SC5314中克隆出SAP2基因，与原核载体pMAL－c2x双酶切后成功构建重组表达质粒pMAL－c2x／SAP2。载体的选择对后期表达出大量可溶性蛋白至关重要。pMAL－c2x载体是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统，含有MBP的E．colimalE基因，其下游的多克隆位点有利于目的基因插入，利用tac强启动子和malE翻译的转录起始信号可以高效表达目的基因。我们选用了E．coliBL21（DE3）作为蛋白表达的宿主菌，此菌种具备ompT蛋白酶缺陷和Lon蛋白酶缺陷的特点，使得BL21（DE3）表达外源蛋白时，不但细胞裂解后的蛋白酶解作用降低，同时胞内转化也减少，从而提高蛋白表达水平。外源基因在E．coli中高表达时，为尽量避免包涵体出现，本研究摸索了IPTG浓度、低温诱导、最佳温度等影响融合蛋白表达效率的条件。于37℃用0．5mmol／L、1mmol／LIPTG分别诱导4、8、12h表达重组蛋白，得到的均为包涵体，将诱导温度降至16℃，IPTG浓度降至0．2mmol／L，诱导时间延长至14h，得到了理想的诱导效果。为获得高纯度的目的蛋白，选用直链淀粉树脂对带MBP亲和标签的融合蛋白进行亲和层析纯化，并用生理缓冲液洗脱，避免了去污剂对蛋白活性的影响。一般来讲，E．coli中合成的融合蛋白通常都是较好的免疫原，但目的蛋白N端MBP标签的存在，可能会影响其生物活性，故获得天然的具有生物活性的靶蛋白，需要将标签去除，E．colimalE蛋白编码序列下游是编码Xa因子识别位点的序列，通过载体上带有位点专一性的蛋白酶FactorXa切除MBP标签，获得高纯度融合蛋白，为下一步免疫动物制备多克隆抗体奠定基础。单克隆抗体虽具备较高的特异性、稳定性和重复性，但存在制备复杂、耗时、成本昂贵等缺点。与之相比，多克隆抗体制备周期短、成本低，制备方法快速、简单，可广泛应用于检测领域，具备良好的应用前景。多克隆抗体成功制备的关键取决于抗原的质量。抗体的高效价、高特异性与抗原的纯度、浓度密切相关。

4结语

不带任何标签，纯度＞90％，浓度为6．5mg／mL，具备较强的免疫原性。单纯使用免疫原免疫动物，免疫效应低，联合佐剂可增强机体对抗原的特异性免疫应答，从而扩大免疫应答效应。与不使用佐剂相比，使用佐剂抗原的剂量可减少10～20倍。免疫得到的抗血清经纯化后可提高特异性，有利于实验室检测Sap2抗原的研究。因为抗血清中含白蛋白等其他蛋白成分，可干扰抗体标记反应及抗原抗体反应，应进行纯化提取单一的IgG抗体成分。多克隆抗体纯化方法包括硫酸铵沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析及亲和层析法等。大量研究证明，亲和层析法是一种最有效的生物活性物质纯化方法，与其他纯化方法相比，除通过对抗体特异性吸附和分离就提纯数百倍外，抗体在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，其余能破坏蛋白成分的蛋白水解酶可以被去除，性质更加稳定，提高了活性回收率。

作者：陈果单位：北京职业技术学院