浅议气味蛋白的分子克隆技术
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1材料和方法
蛹期开始将雌雄分开饲养，羽化后喂以5%的蜂蜜水。养虫室温度为26℃，相对湿度为70%～80%，光周期16D∶8L。总RNA的提取及cDNA第一链的合成为测定气味结合蛋白基因的组织表达谱，取3龄幼虫头部和去除头部的剩余组织，取3日龄雌雄成虫的不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅)，其中，雄虫触角收取30对，雌虫触角收取40对，其他组织适量，重复3次。组织收取后立即放入液氮中，－70℃保存备用。按照说明书，用SVTotalRNAIsolationSystem提取总RNA，然后用M-MLV反转录酶合成cDNA第一链，－20℃保存备用。RACE扩增利用本研究组委托深圳华大科技有限公司测得的二化螟基因组数据，与GenBank中的OBP序列进行比对得到CsupOBP1基因的cDN段。根据片段序列，设计合成5''''GSP和3''''GSP引物。依据扩增试剂盒操作说明，进行RACEcDNA第一链的合成及PCR扩增。PCR产物用1．5%琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带经AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收后，连接到pEASYTM-T3载体上，然后转化到Trans1-T1感受态细胞中。转化后的菌落经蓝白斑筛选，挑取单个白色菌落放入含有0．1%Amp的LB培养液中，在250r/min、37℃下震荡培养12～16h后，采用质粒提取试剂盒(Omega，USA)提取质粒，送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。
2序列分析
测定为了明确二化螟OBP1基因的组织表达谱，利用ABI7500Real-timePCRSystem进行了相对表达量测定。内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因和转录延长因子4(E2F)基因，用于实时荧光定量PCR的引物序列。RT-qPCR反应体系为模板2．0μL，超纯水补足至20μL。采用两步法标准程序进行扩增:95℃预变性30s;95℃5s，60℃34s，共40个循环。反应后进行溶解曲线分析，以排除非特异性PCR产物的污染，空白对照模板以超纯水代替cDNA。蛋白的原核表达与纯化根据二化螟OBP1阅读框序列及表达载体pET-30a(+)设计带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点(以下划线标示)的引物序列。以成虫触角cDNA为模板，采用高保真性和高扩增效率的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，按照PrimeSTAR说明书进行PCR扩增。将PCR产物回收，再连接到pEASYTM-T3载体中并转化到Trans1-T1感受态细胞中，提取质粒DNA并测序验证。将含有目的片段的重组质粒DNA和pET-30a(+)质粒DNA分别进行双酶切，然后将目的片段连接到pET-30a(+)载体，再转化到Trans1-T1感受态细胞中。用含抗生素卡那霉素的LB平板进行筛选，挑取阳性克隆，小量提取质粒进行测序。经测序验证后的质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受态细胞中，涂板培养后挑取单菌落接种于5mLLB培养液(含Kan50μg/mL)中，37℃振荡培养过夜。次日，将所得菌液按1/100(v/v)的比例接种于新鲜的LB培养液(含Kan50μg/mL)中，37℃振荡培养，当细胞生长至OD600=0．6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，37℃下250r/min振荡培养5h。将菌液8000×g离心20min后收集沉淀(菌体)，加入预冷的Resuspensionbuffer(20mmol/LTris-HCl，0．5mmol/LNaCl，pH7．将沉淀重新悬浮，超声破碎后用12000×g离心15min，分别收集上清及沉淀，用SDS-PAGE检测重组蛋白是否为可溶性蛋白。重组蛋白的纯化使用装有填料的亲和层析柱XK16/20，对纯化后的重组蛋白进行肠激酶酶切以切除His-tag标签，酶切后的重组蛋白再次过亲和层析柱。纯化后的目的蛋白经过透析(除盐)、冷冻干燥后，保存于－70℃备用。
3荧光竞争结合实验
缓冲液中，配成蛋白溶液，测定浓度。荧光探针1-NPN和气味物质(植物挥发性化合物，见表2)溶于甲醇中，使其终浓度为1mmol/L，作为工作液。以1-NPN为探针，利用荧光竞争结合实验测定气味物质和OBP间的亲和力已有很多报道(Zhouetal．，2004b;Heetal．，2011;Qiaoetal．，2011;孙红岩等，2011;LiuNYetal．，2012;LiuSJetal．，2012;张婷等，2012;Lietal．，2013)。首先测定CsupOBP1与1-NPN的结合曲线。将蛋白溶液加入20mmol/L的Tris-HCl缓冲液中，使其终浓度为2μmol/L，按和20μmol/L的浓度梯度加入1-NPN，每次加入后反应2min，在337nm激发，记录荧光发射情况，利用其荧光值计算出该蛋白与1-NPN的结合常数，然后利用竞争结合实验测定气味物质和蛋白的结合能力。在竞争结合实验中，蛋白和1-NPN的浓度均为2μmol/L，反应时间为2min，在337nm激发，记录荧光值(初始荧光值)。然后将被测气味物质按终浓度和20μmol/L的浓度梯度加入到1-NPN和蛋白的混合液中，每次加入后反应2min，记录荧光值。对于浓度在20μmol/L时相对荧光值降到60%以下的气味物质，再进行2次重复试验，以3次重复计算有关参数;对于结合能力较低的气味物质，第一次测定后不再进行重复试验。计算荧光值降低到初始荧光值一半时气味物质的浓度，即IC50值，利用公式Ki=IC50/(1+［1-NPN］/K1-NPN)计算各气味物质的结合常数，其中［1-NPN］为未结合的1-NPN浓度，K1-NPN为1-NPN与二化螟OBP1的结合常数(Banetal．，2003)。
4EAG反应测定
触角电位仪为荷兰Syntech公司生产，刺激控制器(型号CS205)的工作条件为直流电、增益200，气流速度为3mL/s。其他参数及详细测定步骤参见Yang等(2009)。被测气味组分用正己烷配制成200ng/μL的工作液，以正己烷为对照。实验时，用微量进样器取5μL滴到滤纸片上(25mm×7．5mm)，放置5min待溶剂挥发后装入巴斯德管内并用封口膜封闭两端，在室温下挥发5～10min后将封口膜去除并将巴斯德管链接到气路装置，进行EAG反应测定。测定试虫为暗期5～8h的2日龄未交配蛾，每个气味组分测定雌雄虫各6头(重复)、每头虫测定1根触角，每个组分在一根触角上连续测定3次(间隔30s)。不同组分(包括对照)的测试顺序在6根触角(重复)间轮换，以消除测定顺序对结果的影响。数据统计与分析在Real-timeqPCR测定中，用Q-Gene软件进行表达量的计算(Mulleretal．，2002;Simon，2003)，用SAS9．0进行数据统计分析，采用t检验进行幼虫不同组织及成虫雌雄间基因表达量的差异显著性分析;采用单因素方差分析及多重比较，检验二化螟对不同植物气味EAG反应间的差异。
5结果与分析
与其他4个鳞翅目昆虫的Minus-COBP的氨基酸序列进行比对表明，CsupOBP1具有Minus-COBP的4个保守的半胱氨酸位点。将CsupOBP1与8种鳞翅目(4种相似性较高的夜蛾科和4种螟蛾科)昆虫的50个OBP构建系统进化树(图2)，发现GOBP和PBP各形成一个大的分支，其余OBP则处于另外2个大的分支上。本研究克隆的CsupOBP1与同为聚在一起，这些Minus-COBP形成一个独立的分支。CsupOBP1基因的组织表达谱为了解CsupOBP1基因的功能，利用RT-qPCR技术检测了CsupOBP1在幼虫及雌雄成虫不同组织的转录水平。结果表明，在幼虫期，CsupOBP1基因在头部的表达量显著高于去除头部的其他组织(P＜0．05);在成虫期，CsupOBP1主要在足和翅中表达，在雄虫的触角和头部也较高的表达，其中在雄虫触角内的表达量显著高于雌虫触角。CsupOBP1在幼虫期的相对表达量远高于成虫期，相差20倍以上。CsupOBP1重组蛋白的诱导表达及纯化为了测定CsupOBP1对不同气味物质的结合能力，将重组质粒pET/CsupOBP1在大肠杆菌中诱导表达并纯化。首先对诱导培养的细胞进行沉淀并破碎处理，然后对破碎的细胞离心分别收取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，发现重组蛋白主要存在于上清中;将上清液经亲和层析柱纯化，得到带有His-tag标签的CsupOBP1;为避免His-tag标签对CsupOBP1功能测定的影响，用肠激酶对纯化蛋白进行处理，切除His-tag标签;处理后的蛋白再次过亲和层析柱，获得大小约14kDa的单一蛋白条带。
作者：魏丹叶占峰高建清董双林单位：南京农业大学
