探究蝗虫基因的克隆与表达

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1fem-1基因在不同组织中的表达模式解剖

羽化后1d成虫的8个不同组织部位，包括头、中肠、卵巢、精巢、脂肪体、体壁、早期胚胎、中期胚胎和晚期胚胎。除精巢、卵巢和胚胎外，其余样品均为雌、雄虫相应组织的混合样品。雌雄虫各3头为1个生物学重复，各组织设3个重复，存于液氮中备用。用Trizol试剂提取总RNA，DNaseI(RNaseFree)酶解残存的DNA，RNA电泳与定量检测后，参照说明书以2μg的总RNA为模板进行cDNA的合成。根据fem-1基因的cDNA序列设计荧光定量PCR引物，以armadillo基因为内参，引物见表1。采用SYBRPremixExTaqTM染料，使用Eppendorf的MastercyclerePrealplex4荧光定量PCR仪进行定量分析。PCR扩增反应总体积为20μL，包括2正反向引物各0．4μL，模板cDNA0．8μL，超纯水8．4μL。扩增程序为:94℃预变性2min;94℃15s，60℃15s，72℃20s，40个循环。重复3次，使用2－ΔΔCT法计算fem-1基因在不同组织的表达情况。

2fem-1基因在精巢发育过程中的表达模式

取5龄雄若虫、羽化后3，6，12和24d的雄成虫各5头，解剖出精巢。若虫为5龄不同时间的混合样品。总RNA的提取、cDNA制备和定量PCR方法同1．4节。数据统计与分析采用SPSS13．0软件对数据进行统计分析，统计数据以平均数±标准差表示。组间差异采用单因素方差(onewayANOVA)分析，两组比较采用Studentt-test进行分析。P＜0．05代表差异显著，P＜0．01代表差异极显著。

3结果

以fem-1为关键词搜索胚胎时期的转录组数据库(未发表)的注释信息，得到，长度分别为2625，2142和2233bp，各有一个完整的开放阅读框。根据Unigenes设计特异性引物，分别扩增3个Unigenes的开放阅读框，测序后获得的序列与转录组数据库中鉴定出的Unigenes的相应序列完全一致。在NCBI上在线比对后发现，这3个Unigenes编码的氨基酸序列与其他物种的Fem-1具有较高的同源性，且具有特征性的锚蛋白重复序列模体，说明这3个Unigenes是的fem-1基因。根据同源性将这3个基因分别命名为Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c，将序列登录到GenBank，登录号分别为和基因的序列分析Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c基因的序列特点。BLAST分析发现Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c之间的同源性较低，Lmfem-1a与Lmfem-1b，Lmfem-1a与Lmfem-1c以及Lmfem-1b与之间的氨基酸序列一致性分别为25．55%，32．20%和35．40%，但与其他物种相应基因的同源性较高。例如，Lmfem-1a与丽蝇蛹集金小蜂Fem-1(GenBank登录号:XP_001606383)的氨基酸序列一致性最高，达66．21%，与人体虱和赤拟谷盗Fem-1(GenBank登录号:XP_967114)的氨基酸序列一致性分别为65．12%和58．47%;Lmfem-1b与赤拟谷盗Fem-1b(XP_975561)的氨基酸序列一致性最高，为70．10%，与人Fem-1b(GenBank登录号:NM_015322)的氨基酸序列一致性为53．43%;Lmfem-1c与赤拟谷盗Fem-1(GenBank登录号:XM_001811644)的氨基酸序列一致性最高，为63．96%，与人Fem-1c(GenBank登录号:NM_020177)的氨基酸序列一致性为53．21%。Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c与线虫Fem-1的氨基酸序列一致性分别为25．04%，26．91%和34．74%将Fem-1与分属于双翅目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鳞翅目等昆虫以及人、鼠等脊椎动物的Fem-1蛋白序列进行比对，并用NJ法绘制了分子系统发育树，利用自举分析(Bootstrap，1000次重复)检验各分支的置信度。由进化树可以发现:Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c分别与其他物种的Fem-1a，Fem-1b和Fem-1c聚到一起，形成明显的三支。Lmfem-1a与人体虱Fem-1(GenBank登录号:XP_002426405)的亲缘关系最近，Lmfem-1b与丽蝇蛹集金小蜂Fem-1b(GenBank登录号:NP_001153369)和赤拟谷盗Fem-1b(GenBank登录号:XP_975561)的亲缘关系最近，Lmfem-1c与赤拟谷盗Fem-1(GenBank登录号:XM_001811644)的亲缘关系最近，与同源性比对结果一致。ScanProsite功能序列分析结果表明，Lmfem-1a有6个锚蛋白重复序列模体，而Lmfem-1b和Lmfem-1c分别有8个锚蛋白重复序列模体。Lmfem-1a，Lmfem-1b和Lmfem-1c均无信号肽序列，也无跨膜结构域，属于细胞内在蛋白质。

作者：时红郝友进陈斌司凤玲王鹏何正波单位：重庆师范大学