探究DN段的制备技术

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1概述

2代载体（YAC、BAC、PAC）YAC载体能够携带的动物片段长度为900～1000kb；植物片段的长度为100～350kb，用YAC构建的基因组文库只需要较少的克隆就可以覆盖整个基因组。Phan等利用电击法将YAC转入番茄中，并在番茄中获得了稳定的转基因细胞系，Adam等［5］、Flynn等［6］将同样的方法应用在烟草中，但是YAC的稳定性差、操作不便、具有自身难以克服的缺点［7－8］。BAC载体能携带的外源dnA长度为100～350kb，容量没有YAC大，但相比之下BAC拥有更多的优点。Choi等用pBACwich载体构建了棉花的BAC文库，并利用基因枪法使一部分克隆转化到烟草中，证明了外源DNA片段可整合到染色体的特定位点上。Song等将从高粱中获得的90kb的BAC克隆利用基因枪法成功转入到玉米中，并在玉米后代中检测到外源基因的高效表达。Ioannou等构建了1个P1载体（pCYPAC－1），并通过电穿孔法将重组DNA转入到大肠杆菌中。这个新型的克隆载体能够承载平均大小为130～150kb的片段，并且没有明显的嵌合和缺失现象，因此可以用来绘制物理图谱和分析复杂的基因组。日本水稻基因组计划就是用PAC文库构建的物理图谱。Hamilton等［设计了1个既可以承载重组质粒又可以转化植物的载体即双元细菌人工染色体（BIBAC），这一载体可将大片段转入植物中，并成功的将150kb的人类基因组DNA通过农杆菌介导的方法转入到烟草中，通过对转化烟草后代的鉴定发现此外源基因可以稳定的遗传表达。Hamilton等［构建了世界上第1个番茄的大片段BIBAC文库。大片段的基因组文库的构建，使很多全长基因的筛选和获得均成为可能。目前，已知的以BIBAC为载体构建的文库有烟草、番茄、拟南芥、水稻、药用野生稻、大豆及人参。这一载体是大片段DNA转化植物最为有用的载体。可转化人工染色体（TAC）为加快从植物基因分离定位克隆，这就要求载体系统要适应于染色体步移和遗传互补，因此，Liu等构建了可转化的人工染这一载体系统能够保证大片段DNA在大肠杆菌和农杆菌中都保持稳定，并运用这一载体获得了转基因拟南芥以及转基因水稻，这一载体的出现弥补了YAC、BAC在定位克隆研究中的缺陷。

2大片段DNA制备技术

通过使用96孔板作为提取容器，将研磨后的植物样本放入不同孔中进行提取，1人1d可提取近千个样本。大片段DNA遗传转化的方法及其影响因素当前根据有无载体可将转化方法分为2类：1类是以质粒DNA等为媒介的遗传转化，即将目的基因插入到农杆菌的质粒等载体上，伴随着质粒DNA的转移将目的基因转入到植物中，如叶盘法、原生质体法、真空渗入法、脂质体法等；另1类为不需要载体的转化方法，如基因枪法、花粉管通道法、电击法、微注射法、聚乙二醇法、硅化纤维法等。1982年通过农杆菌介导的方法获得了全世界第1株转基因植物烟草，这标志着转基因时代的全面到来。目前农杆菌介导法应用依然最广，在获得的百余种转基因植物中，有80％是通过农杆菌介导的方法获得的。菌种和宿主范围农杆菌菌株种类很多，每种菌种所具有的毒力也就是侵染能力各不相同，因此每种菌种都有其适宜侵染的最适合宿主。一般而言，农杆菌菌种侵染能力强弱依次为农杆碱型菌株、胭脂碱型菌株、章鱼碱型菌株。农杆菌碱型菌株有EHA胭脂碱型菌株有C58、GV3101，章鱼碱型菌株有LBA4404、Ach5，选择对受体植物较为敏感的菌株是转化成功的重要因素。同一种植物对不同菌株的敏感程度也不相同，如Hiei等在对水稻的研究中发现，EHA101（pTOK233）不如LB4404（pTOK233）效果好；在西瓜中，EHA105的侵染能力明显优于LBA4404和AGL－1，转化率可达76．7％。农杆菌宿主范围广泛，可转化许多双子叶植物、单子叶植物和裸子植物，此外，农杆菌也可以转化真菌，如酵母、子囊菌和担子菌。近期的报道农杆菌将DNA转化到了人类细胞。

作者:石玉蒋世翠张美萍孙春玉王康宇王义单位：吉林农业大学