浅谈无浆体的克隆及表达实验
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1材料与方法
1.1实验动物
普通级新西兰白兔，3～4月龄，体重2.5～3.0kg，购自哈药集团制药总厂动物实验中心，动物合格证号：SCXK（黑）2011-005；商品蛋鸡购自黑龙江省大庆市禽蛋公司养鸡场。
1.2菌株及质粒
主要试剂T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、PfxplatinumDNA聚合酶、DNAmarker、AgaroseGelDNAExtractionKit、质粒快速提取试剂盒及低相对分子质量蛋白质marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；X-gal和IPTG购自武汉华美生物工程有限公司；EcoRⅠ、SalⅠ、牛血清蛋白、Giemsa染色液、酵母提取物和胰蛋白胨购自上海生工生物工程技术服务有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗MSP1α和MSP1β多克隆抗体由本院预防兽医学实验室自制；HRP标记的山羊抗兔IgG购自，INC公司；FITC标记的兔抗鸡IgG购自上海华壹生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。1.5MSP1α和MSP1β基因的扩增按细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增MSP1α和MSP1β基因。MSP1α基因反应条件为：94℃预变性5min；94℃1min，55℃1min，68℃1min，共30个循环；68℃延伸7min。MSP1β基因反应条件除将退火温度升高至63℃，其他同上。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2重组表达
将鉴定正确的阳性质粒和pGEX-6p-1分别经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，回收目的基因片段及载体片段，经T4DNA连接酶14℃连接2h，转化感受态E.coliBL21（DE3），挑取阳性克隆，提取质粒，经PCR及双酶切鉴定。鉴定正确的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的重组表达质粒分别命名为pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β。目的基因的诱导表达将测序正确的重组菌和空载体转化菌各100μl接种于4ml含100μg／mlAmp+抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；分别取50μl新鲜菌液，转接至50ml含40μg／LAmp的LB液体培养基中，37℃200r／min振荡培养，至菌体A600值为0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol／L，200r／min振荡培养，分别于3、4、5和6h收集1.5ml菌液，冰浴超声破碎，10000×g离心10min，分别收集上清和沉淀，进行12%SDS-PAGE分析。
3表达产物的纯化及鉴定
表达产物经12%SDS-PAGE分离后，将目的蛋白切胶后收集至透析袋中，120V水平电泳1h，待胶透明后，取出置PBS缓冲液中，4℃透析过夜，收集液体，用超滤离心管进行浓缩。取30μg纯化的蛋白，电转膜后，置5%脱脂奶粉室温封闭1h；分别加入兔抗MSP1α和MSP1β多克隆抗体（均1∶100稀释），37℃孵育1h；加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5000稀释），37℃孵育1h；DAB法显色，蒸馏水洗涤，终止反应。重组蛋白多克隆抗体的制备用2只新西兰白兔进行高免血清的制备，用2只商品蛋鸡进行抗MSP1α和MSP1βIgY抗体的制备。将纯化的重组蛋白100μg加等体积的完全弗氏佐剂进行初免，将纯化的重组蛋白100μg加等体积的不完全弗氏佐剂进行2、3次免疫，每次免疫间隔14d。白兔经皮下注射接种，鸡经肌肉注射接种。在末次免疫5d后，经白兔耳缘静脉采血，分离血清，进行Westernblot鉴定，具体操作同1.8项。商品蛋鸡从免疫前1周至末次免疫后2周，每日收集鸡蛋，采用聚乙二醇沉淀法提取鸡蛋中IgY抗体：将卵黄从卵清中分离出来，取10ml卵黄，加入100ml磷酸钠盐缓冲，再加入5ml氯仿，至有半固体状物质出现后，10000×g离心，收集上清，加至5ml聚乙二醇中，10000×g离心，收集沉淀，重悬于磷酸钠盐缓冲液中，置-20℃保存备用。1和MSP1β蛋白在大肠埃希菌外膜表达的检测采用间接荧光免疫法。取诱导表达的重组菌，经PBS（pH7.2）洗涤后，涂布固定至载玻片上，用含1%BSA的PBS37℃封闭60s；在分离的IgY抗体中孵育60s；PBS洗涤，加入FITC标记的兔抗鸡IgG（1∶1000稀释），37℃孵育30s；PBS洗涤，荧光显微镜下观察，视野中呈现黄绿色荧光判为阳性。1.11MSP1α和MSP1β蛋白对牛红细胞黏附作用的检测用于血凝试验和血凝抑制试的血液采自经PCR方法检测A.marginale阴性的牛（来自黑龙江某集约化牛场）。抗凝血经PBS洗涤5次后，置含1%戊二醛的PBS中，4℃固定12h后，置含1.5mol／L叠氮化合物的PBS中备用；将约5×107个／ml的红细胞加至约2×109个重组表达菌中，进行HA试验，混匀，37℃振荡温育30min；PBS洗涤，重悬于等体积PBS，制作血细胞涂片，甲醇中固定15min，进行Giemsa染色，红细胞凝集百分数通过对吸附到红细胞上的细菌计数来确定。取免疫后分离的IgY抗体0.5ml，分别加至约2×109个诱导表达的重组菌中进行HI试验，制备稀释度为1∶2、1∶3和1∶5的IgY抗体，37℃温育30min；将约5×107个红细胞加至含1.5mol／L叠氮化合物的PBS中，37℃温育30min；PBS洗涤，重悬于等体积PBS，制作血细胞涂片并计算红细胞凝集百分数。
作者：倪宏波钱爱东姜海芳单位：黑龙江八一农垦大学
