略谈克隆细胞的医学作用

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一、资料

纯化产物的鉴定纯化产物经Westernblot分析，无杂带（图略）。纯化的重组MSP1α和MSP1β蛋白纯度分别可达93%和91%。重组表达质粒的鉴定以重组质粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β为模板进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见774和2300bp的目的基因条带，大小与预期相符；重组质粒pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β的双酶切产物可见774和2300bp的目的基因片段，大小与预期相符。MSP1α与MSP1β基因测序结果与GenBank上登录的基因序列核苷酸同源性均达95.5%，氨基酸同源性分别达89.5%和90.0%。表达产物的鉴定重组菌的最佳诱导时间均是4h，表达产物经12%SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约58000的MSP1α蛋白条带及107000的MSP1β蛋白条带，大小与预期相符。表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在，MSP1α和MSP1β表达量分别占菌体总蛋白的31%和14%。

二、重组蛋白免疫原性的鉴定

在相对分子质量约58000和107000处可见特异性反应条带，而阴性对照（MSP1α蛋白加入兔抗MSP1β血清或MSP1β蛋白加入免抗MSP1α血清）无此条带重组蛋白在大肠埃希菌外膜的表达IFA法检测结果显示，免疫前的IgY抗体不能与表达MSP1α和MSP1β蛋白的重组菌发生反应，而1∶800稀释度以上的抗MSP1α和MSP1βIgY抗体均可与表达MSP1α和MSP1β蛋白的重组菌发生反应。。重组蛋白对牛红细胞的黏附作用HA检测结果显示，重组MSP1α和MSP1β蛋白可黏附至牛红细胞上，表达MSP1α蛋白的重组菌对红细胞的吸附率为56.4%，表达MSP1β蛋白的重组菌对红细胞的吸附率为52.7%，空菌体对红细胞的吸附率仅为9.6%，见图7。HI检测结果显示，经抗MSP1α和MSP1β的IgY抗体处理后的MSP1α和MSP1β蛋白对红细胞的吸附率分别为6.8%和9.4%，经PBS处理后的MSP1α和MSP1β蛋白对红细胞吸附率分别为53.2%和49.3%3讨论Viseshakul等于2000年从佛罗里达分离株中分离的A.marginale对MSP1β基因的测序明确了两个编码MSP1β1和MSP1β2全长基因。Camacho-Nuez等也于2000年从佛罗里达分离株中发现另外3条MSP1β全长基因。MSP1α细胞外氨基末端区域包含串联重复序列，这些序列与A.marginale对牛红细胞和蜱细胞的黏附密切相关。MSP1α与A.marginale通过蜱的感染及传播有关。本实验中表达的重组MSP1α和MSP1β蛋白可诱导兔和鸡产生特异性的抗体，该抗体可与重组MSP1α和MSP1β蛋白发生特异性反应；MSP1α和MSP1β蛋白可在大肠埃希菌细胞外膜上表达，无表达时采用IFA检测，荧光强度减弱，表明MSP1α和MSP1β蛋白可能是A.marginale对蜱和牛红细胞黏附力的基础。重组MSP1α和MSP1β蛋白在大肠埃希菌表面可凝集牛红细胞，而抗MSP1α和MSP1βIgY抗体均可抑制该凝集，提示MSP1α和MSP1β蛋白对红细胞有黏附功能。HA试验结果显示，重组MSP1α蛋白对红细胞的吸附率为56.4%，而重组MSP1β蛋白对红细胞的吸附率为52.7%。经抗MSP1α和MSP1βIgY抗体处理后的MSP1α和MSP1β蛋白，对红细胞的吸附率分别仅有6.8%和9.4%，与Tamekuni等的研究结果相似，Tamekuni等认为A.mar-ginale能识别牛红细胞的表面受体，并可相互作用，表明MSP1α和MSP1β蛋白对红细胞有黏附功能。

三、总结

综上所述，本实验阐明了A.marginale中MSP1α和MSP1β重组蛋白菌外膜上获得有效表达，并确认了MSP1α和MSP1β蛋白在侵入红血球过程中起到黏附素的作用，表明这2种蛋白在控制牛A.marginale感染方面具有重要作用。以其为研究对象进行A.marginale亚单位疫苗的研制也取得了相应的成果。随着对牛边缘无浆体病认识的不断深入，与其相关的基础研究和应用研究必将得到进一步开展，尤其在该病的防控、致病机理及新型疫苗研制等方面将取得突破性的进展。

作者：胡林森单位：新疆国防大学