小结抗体制备的实验方法
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1材料与方法
材料金银花新鲜花蕾于2011年4～5月采自山东临沂,凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所。经李圣波鉴定后样品保存于80℃冰箱中,备用。
2基因克隆
依据金银花LJPAL1(JX068601)基因编码区序列,利用软件Primer-Premier5设计引物:;利用金银花反转录一链cDNA作为模板进行PCR反应,用于全长cDNA的扩增。PCR反应体系为:,模板1μL,引物应程序:94℃预变性5min,然后进行30个循环,循环结束后72℃10min,4℃保温。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,利用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物有限公司)回收目标PCR产物,并将其与pMD19-T载体连接,转化DH5α感受态细胞,在含有氨苄青霉素的LB培养基上进行蓝白斑筛选,选择阳性克隆送北京六合华大基因公司测序。将鉴定正确的质粒命名为pMD19-PAL1,并利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工生物有限公司)提取质粒。
3原核表达载体构建
分别将pMD19-PAL1、pET-32a(+)载体质粒用SalⅠ37℃酶切2h后,NotⅠ继续酶切2h,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物有限公司)分别回收2.1kb、5.9kb左右的目的条带。将两片段在T4Ligase连接体系中,于16℃连接过夜。连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞,并利用PCR进行阳性克隆鉴定,引物序列、PCR体系和程序同上。挑选阳性克隆送北京六合华大基因公司测序。所构建的原核表达载体,包含完整的LJPAL1的基因编码区,重组质粒命名为pET32-PAL1。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(TaKaRa公司),并利用PCR进行阳性克隆鉴定,引物序列、PCR体系和程序同上。挑选阳性克隆北京六合华大基因公司测序。
首先使用的是Geneious软件进行二级结构和亲疏水性的预测,着重选择有β-转角、无规则蜷曲、亲水的肽段;再使用SWISS-MODEL/)预测三级结构,着重选择暴露在蛋白表面的肽段;根据以上信息综合分析选择最佳肽段作为候选抗原位点,并合成多肽抗原,制备多克隆抗体。取200μg免疫原,用生理盐水稀释到200～500μL,再加入等体积弗氏佐剂,初次免疫用弗氏完全佐剂,加强免疫用弗氏不完全佐剂;用混匀仪器将溶液和佐剂混匀,形成油包水。将混匀好的免疫原在2.0kg左右的新西兰大白兔背部皮下注射免疫,打8～10个点。每隔12天加强免疫一次,每次免疫量为200μg蛋白。第3次免疫后10～15天采血,采用Protein-G亲和纯化相应的多抗血清,获得诱导6h后的大肠杆菌细胞总蛋白经SDS-PAGE电泳后,于20V恒压下转移至硝酸纤维素膜,时间约为40min。用5%脱脂奶粉封闭1h后按1∶2000稀释比例加入一抗(LJPAL1多克隆抗体),60r·min1振荡反应1h,经PBST洗涤后按1∶8000稀释比例加入二抗(羊抗兔IgG,北京中杉金桥生物技术有限公司),60r·min1振荡反应1h。用化学发光显色试剂盒显色,采用UVP化学发光凝胶成像系统观察显色结果。7酶联免疫吸附分析(ELISA)利用间接ELISA方法进行LJPAL1蛋白含量分析。取含有pET32-PAL1质粒的大肠杆菌诱导表达,菌液超声破碎后分别利用PBS缓冲液,溶于1L蒸馏水中,pH7.稀释倍作为抗原,以PBS作为对照。包被PBS稀释菌液,一抗为稀释1000倍的金银花PAL1多克隆抗体,二抗为羊抗兔IgG(1∶1000),最后以邻苯二胺底物显色,硫酸终止反应,用酶联免疫分光光度计检测490nm处的OD值。
作者：冯洁单位：北京科技大学
