探究病毒的克隆技术

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1材料与方法

基因DNA模板、PCMV阳性血清、表达载体pET32a（＋）均由四川农业大学动物生物技术中心提供，2月龄健康雄性白兔（体重2kg）购自雅安市某家兔养殖基地。克隆载体pMD19－TSimple，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA连接酶、IPTG、蛋白质Marker购自大连宝生物工程有限公司；、质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、购自北京天根生化科技有限公司；N，N’－亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、SDS、TEMED、考马斯亮蓝R－250、2－巯基乙醇、溴酚蓝、琼脂糖、甘油、氨苄青霉素、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、硫酸铵等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他化学试剂均为分析纯。引物的设计与合成应用．0b等分子生物信息软件对PCMVgB基因及其编码氨基酸序列进行生物信息学分析，并选择gB基因2305～2574bp优势抗原表位区作为目的序列，参照NCBI上的猪巨细胞病毒gB基因序列（登录号：FJ844360．1），应用Oligo7．0软件设计引物P1、P2，在引物P1、P2的5′端分别引入酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ，用于PCR产物与表达载体的连接，并在引物P1、P2酶切位点后分别引入起始密码子ATG和终止密码子TAG。P1／P2扩增的目的片段长270bp，上述引物送上海Invitrogen生物技术有限公司合成，引物序列如下（下划线处为EcoRⅠ酶切位点），下划线处为HindⅢ酶切位点）。PCMVgB基因优势抗原表位区的PCR扩增以gB基因DNA为模板，分别以P1、P2为上游引物和下游引物，对PCMVgB基因优势抗原表位区进行体外扩增。PCR反应的程序为：94℃预变性，经30个循环后，于72℃延伸8min。基因优势抗原表位区表达载体的建立及重组蛋白的表达与纯化将PCR产物于琼脂糖凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段，将目的片段连入pMD19－TSimple克隆载体并转化入E．coliDH5α后抽提质粒，进行质粒基因组测序，并使用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切，将酶切后的目的片段连接入pET32a（＋）载体，并命名重组质粒为pET32a（＋）－gB，转化入E．后将重组表达菌命名为E．。使用浓度为0．2mg／L的IPTG诱导E．重组表达菌表达后，将表达产物通过组氨酸标签融合蛋白纯化柱进行纯化，并测定纯化后的蛋白质浓度。PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白的反应原性分析以纯化的PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白作为抗原，PCMV阳性血清为一抗，以HRP标记的羊抗猪IgG为二抗进行试验，并设置PCMV阴性血清对照组，鉴定PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白的反应原性。多克隆抗体的制备及抗体效价的测定使用纯化后的PCMVgB基因优势抗原表位区重组蛋白与弗氏佐剂按1∶1体积比进行乳化后制成油乳剂，对健康家兔进行免疫，第4次免疫完成后对试验家兔采取心血，将血液收集至离心管中，先于常温倾斜放置30min，再转至37℃培养箱中放置1h，最后转入4℃冰箱中放置过夜，于4000r／min离心15min分离血清。将分离的血清无菌进行分装后于－20℃保存备用，并避免反复冻融。以纯化后的PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白（质量浓度为0．62μg／mL）作为抗原，以琼脂扩散试验验证经PBS缓冲液稀释后的多克隆抗体效价。鉴定以纯化的PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白作为抗原，制备的多克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Western－blot鉴定，以免疫前的家兔血清作为阴性对照，鉴定该多克隆抗体的反应性。

2讨论

自1950年PCMV在英国被发现以来，该病毒就因为其免疫抑制特性以及能够通过跨物种器官移植而感染人与其他动物而备受关注，但由于该病毒分离困难，导致了对该病毒的研究一直落后于其他疱疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B（gB）是PCMV重要的跨膜糖蛋白，也是特定细胞毒T淋巴细胞的主要靶蛋白，是淋巴因子激活的自然杀伤细胞的识别对象，且gB蛋白具有良好的免疫原性，并在诱导机体体液免疫和细胞免疫中起着重要作用，对该蛋白进行研究有助于了解PCMV的感染机制，为该病毒感染的防治奠定了基础。本试验构建了pET32a（＋）－gB高效重组表达质粒，应用原核表达系统以可溶性形式高效表达了PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白，成功表达并纯化了PCMVgB优势抗原表位区重组蛋白，并验证了其具有良好的反应原性，可以作为间接ELISA检测的包被抗原，通过琼脂扩散试验和Western－blot试验，也证实了制备的多克隆抗体可以与gB蛋白特异性结合。本研究为进一步分析PCMVgB蛋白的生物学特性，建立PCMV抗体血清学诊断方法奠定了重要基础，为制备早期检测PCMV抗体的检测试剂盒奠定了基础。

作者：江一帆刘骁单位：四川农业大学