探究病毒的原核表达

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1材料与方法

实验材料基因工程菌pRSET-N-BL21、PRRSV由动物医学院传染病组馈赠；兔抗PRRSV高免血清由本实验室通过灭活的全病毒免疫后制备保存；伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）由本实验室保存；DMEM、HAT及HT为美国GIBCO公司产品；PEG-1500及MouseMonoclonalAntibodyIsotypingKit为Roche公司产品；新生牛血清购自杭州四季青公司；SP2/0骨髓瘤细胞由江苏农科院畜牧兽医研究所馈赠；Balb/c小鼠、清洁级小鼠购自重庆医科大学。PRRSV核衣壳蛋白的诱导表达、纯化和鉴定将基因工程菌pRSET-N-BL21自然融化后接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的2×YT琼脂平板上，37℃恒温孵育18h。于2×YT琼脂平板上挑取单菌落，接种到5ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的2×YT液体培养基中，37℃振荡过夜。然后按1∶100的接种量进行二次活化，200r/min，37℃摇床振荡培养，菌体密度生长至对数期后。将各培养管按IPTG浓度梯度（1mmol/L、0.5mmol/L）和温度梯度（37℃、30℃、20℃）诱导4h，所有管每隔1h取样一次（每次0.5ml），将样品进行SDS-PAGE电泳分析确定最佳诱导条件。按优化的最佳条件重新诱导表达，并于最佳时间取样40ml经超声破碎后，分别取破碎后上清与沉淀，利用SDS-PAGE检测表达蛋白的相对分子质量，表达形式，并利用Westernblot鉴定目的蛋白。随后对该工程菌按最佳条件进行扩大培养，采用His-Ni2+亲和层析纯化重组N蛋白，纯化产物用SDS-PAGE电泳鉴定。分泌抗高致病性PRRSVN蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立将纯化的PRRSVN蛋白，常规法免疫、细胞融合制备单克隆抗体杂交瘤细胞株。阳性杂交瘤细胞的稳定性试验杂交瘤细胞继代培养6个月以上，定时用ELISA间接法测定培养上清抗体效价.分别复苏冻存1个月，2个月，4个月，8个月和12个月的阳性杂交瘤细胞，用ELISA间接法测定细胞培养上清及细胞诱生小鼠腹水的抗体效价。单抗的亚型鉴定按试剂盒说明书操作。杂交瘤细胞染色体分析取对数生长期的杂交瘤细胞，经秋水仙碱、0.075mol/LKCl溶液处理，固定制片后染色，油镜下观察染色体并记数。单抗特异性鉴定将表达的PRRSVN蛋白以4μg/ml包被，以4G10单抗腹水及其它病毒，如伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（HCV）、猪细小病毒（PPV）的特异性多抗为一抗，用间接ELISA法检测单抗特异性。

2结果

按该条件重新诱导N蛋白的表达并通过超声破菌，经结晶紫染色发现破菌比较彻底。将细菌裂解液离心后分别收集上清和沉淀重悬液，行SDS-PAGE分析，结果发现，上清液中N蛋白的含量明显高于沉淀中含量，说明在该条件下N蛋白主要以可溶性形式存在，包涵体中含量较少。将诱导表达产物用兔抗PRRSV高免血清进行Westernblot分析，结果显示阳性，表明重组N蛋白成功表达。重组N蛋白经过IPTG诱导表达后，通过His-Ni2+亲和层析纯化带有6His的融合蛋白，经SDS-PAGE分析表明，获得的重组蛋白纯度较高，但含有部分杂蛋白，也可能有少量的二聚体的形成抗高致病性PRRSVN蛋白单抗杂交瘤细胞株的建立本实验一次融合共分装384孔，融合成功312孔，融合率达81.3％，ELISA初检阳性率达17.3％；选择阳性值较高的20个孔亚克隆，经过2次亚克隆，不断反复筛选得到了2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为4G10及2F9。融合后的杂交瘤细胞如图3，细胞融合的筛选结果如表1所示。单抗的生物特性鉴定阳性杂交瘤细胞稳定性试验4G10和2F9细胞株继代培养6个月以上，其培养上清ELISA效价仍保持在1∶1024～1∶2048，分别冻存1、2、4、6个月后复苏，其诱生腹水的Mabs效价仍保持在1∶25600～1∶51200之间杂交瘤细胞染色体分析对4G10和2F9细胞株杂交瘤细胞分裂相染色体形态进行观察，可见到端着丝点和中间着丝点，染色体数目介于100～110条之间，具有杂交瘤细胞染色体特征。单抗特异性鉴定将PRV、HCV、PPV特异性抗体和4G10小鼠腹水进行梯度稀释，分别与重组N蛋白包被的酶标板进行反应，重复3次，结果表明：重组N蛋白与4G10单抗反应较强烈，而与其它病毒抗体不反应，说明所得到的单抗具有较好的特异性。

作者:吴胜昔邵烈刚单位：重庆理工大学