探讨毒杆菌基因的克隆方法

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1材料与方法

毒杆菌分离菌株FZ2007－1和FZ2007－2、DH5α均为福建省农科院畜牧兽医研究所分离鉴定并保存。工具酶与主要试剂聚合酶、胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；细菌DNA提取试剂盒、普通肉汤培养基和普通肉汤琼脂培养基均从BDDifco公司购买；脱纤绵羊血购自郑州益康生物工程有限公司。猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA基因PCR引物合成参考副猪丹毒杆菌C43065株的SpaA基因序列设计了1对可以扩增SpaA全长基因的特异性引物，上游引物，下游引物S，预期扩增片段为1881bp，引物由TaKaRa公司合成。猪丹毒杆菌DNA的提取复苏甘油冻存的细菌，即用接种针蘸取冻存的细菌，划线接种于含5％脱纤绵羊血的普通肉汤琼脂平板中，37℃倒置培养过夜；挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基中，37℃振摇培养过夜；离心沉淀后加入PBS重悬，应用DNA提取试剂盒按照说明书提取细菌DNA，－20℃保存备用。猪丹毒杆菌SpaA基因的PCR扩增、克隆和测序以提取的基因组DNA为模板进行PCR反应。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性，72℃延伸1．5min，35个循环；72℃再次延伸10min。电泳后切胶用胶回收试剂盒回收DNA片段并与pMD18－T载体连接，转化DH5α感受态细菌，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板上，挑取细菌进行扩大培养，提取质粒，通过PCR鉴定，选取阳性质粒送TaKaRa公司测序。猪丹毒杆菌SpaA基因的同源性比对分析应用DNAman生物软件，对所测2株猪丹毒杆菌SpaA基因序列与GenBank中登录的部分猪丹毒杆菌菌株的SpaA基因进行同源性比较，并进行发育进化树分析。猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA的理化性质及功能域分析选取1株猪丹毒杆菌分离株为研究对象，应用ExPASy工具对猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA的性质进行分析；应用ProtParam分析酶的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性质；分析酶的功能域进行蛋白信号肽预测。猪丹毒杆菌SpaA基因二级结构预测应用EXPASY服务器上的SOPMA方案分析预测猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构。猪丹毒杆菌保护性抗原SpaA蛋白的B细胞表位预测采用Hopp－Woods亲水性参数、Zim－merman极性参数、柔韧性参数、抗原性参数和Emini表面可及性参数分别进行单参数预测。对各个参数的预测结果进行比较，最后进行综合分析以确定猪丹毒杆菌SpaA蛋白的B细胞表位。

2结果

电泳条带经回收、克隆，以克隆后提取的质粒为模板进行PCR阳性鉴定正确。猪丹毒杆菌SpaA基因的发育进化树分析应用DNAman软件对目的条带的测序结果和Gen－Bank中部分猪丹毒杆菌菌株的SpaA基因进行发育进化树分析，结果发现本试验分离的2株猪丹毒杆菌菌株与GenBank中其他菌株在进化树中分布较远，自成一个分支。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的理化性质分析选择猪丹毒杆菌FZ2007－1分离株作为代表性毒株进行分析。用E分析猪丹毒杆菌的理化性质，结果显示，该酶有626个氨基酸，其相对分子质量为72190．3，理论等电点（PI）为9．04，为偏碱性蛋白质。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的信号肽预测用分析SpaA蛋白的氨基酸序列信号肽的存在位置及序列，结果显示，该酶氨基酸序列上信号肽的剪切位点位于第29～30个氨基酸。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的功能域分析将猪丹毒杆菌SpaA蛋白的氨基酸序列提交到ScanPro－site服务器，对SpaA蛋白进行翻译后修饰位点结构分析。结果表明，该蛋白有1个组蛋白赖氨酸N－甲基转移酶家族元件，1个细胞壁结合重复元件，8个肉豆蔻酰化位点猪丹毒杆菌SpaA蛋白的二级结构通过NPS＠服务器上的SOPMA方案预测SpaA蛋白的二级结构成分，结果表明，该蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲组成，其中，α螺旋有335个、占53．51％，延伸链有78个、占12．46％，β转角有66个、占10．54％，无规则卷曲有147个、占23．48％。猪丹毒杆菌SpaA蛋白的B细胞表位预测分别对SpaA蛋白的极性、亲水性、柔韧性、抗原性和表面可及性参数进行预测，B细胞抗原表位的数目及抗原表位可能出现的肽段有所不同，但均显示，各种方案所预测的参数值均高于其他区段。因此，以上多个区段形成B细胞表位的可能性最大。

3讨论

结果表明该片段能够防止杆菌对猪的感染。Shimoj等也通过表杆菌SpaA蛋白N端2／3区域，免疫小鼠后，小鼠可产生较强的免疫保护力。对于蛋白的B细胞表位预测，已有多种单参数预测模型和相应的分析软件，但为了克服单参数预测模型的局限性，提高预测的准确性，一般对多种参数的预测结果进行综合考虑，其中比较重要的参数为亲水性参数、极性参数和柔韧性参数。通常蛋白质的二级结构与蛋白质的B细胞表位有较大的关系。猪丹毒是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性人畜共患传染病，其主要特征表现为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎。该病分布广泛、世界各地均有发生，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。特别是在最近2年，由于“高热病”的暴发，导致猪群免疫力下降，猪丹毒在全国各地均有零星发生的报道，并有小范围流行的可能性［19－20］。近几年来，对猪丹毒杆菌的分子生物学和免疫学进行了一些研究，吾鲁木汗·那孜尔别克等对猪丹毒杆菌SpaA基因的原核表达和重组疫苗的研究结果表明，SpaA蛋白具有良好的免疫保护作用。晏鹏飞等通过研究表明猪丹毒杆菌表面保护性蛋白A起主要保护功能的核心区段为氨基端，且是由抗体介导的免疫保护。Aimad等克隆和表达了编码SpaA蛋白N端的基因片段，通过West－ernblot检测其免疫功能，本试验运用SOPMA方案预测蛋白质的二级结构，结合亲水性方案、极性方案、柔韧性方案、Emini表面可及性方案和Jameson－Wolf抗原性指数方案多种方法综合分析，发现该酶以α螺旋（占53．51％）、无规则卷曲（占23．48％）、延伸链（占12．46％）为主，而β转角只占10．54％；并应用不同的方案预测了B细胞表位的优势区。本研究基于猪丹毒杆菌SpaA蛋白的氨基酸序列，通过对其二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性与抗原性等多种参数进行综合分析，预测了SpaA蛋白可能的B细胞优势表位，为寻找特异性相关表位用于疫苗的设计、诊断试剂研发、免疫机理的探讨等提供了理论依据，同时也为猪丹毒杆菌SpaA蛋白功能研究提供了线索。

作者：林琳江斌吴胜会张世忠单位：福建省农业科学院