赤柏松研究论文：赤柏松生物技术研究状况

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本文作者：王启业王义强凡利作者单位：中南林业科技大学生物技术实验室

南方红豆杉细胞培养及次生代谢研究

红豆杉资源非常有限且紫杉醇含量极低，远远无法满足市场的需求。植物细胞培养具有繁殖速度快，培养条件易于优化，培养过程易于人工控制，不受时间、地域等因素的限制等优点。因此，采用红豆杉细胞培养生产紫杉醇以及对紫杉醇合成代谢途径进行调控来提高紫杉醇的产量已成为当今国内外学者研究的热点课题之一，并已取得了较大进展。对其细胞培养、紫杉醇合成与代谢调控、扩大培养及分离纯化[16-19]等方面开展了广泛深入的研究，研究发现，营养调控[20-23]、物理控制[24-26]、前体饲喂[27]、添加抑制剂[28]、诱导子调控[20-21,29-33]、双液相培养[34]、两步法培养[35]等一系列技术均能影响南方红豆杉的次生代谢。细胞离体培养缩短了培养周期，这样不仅有利于培养条件的优化，也为通过多种诱导途径来提高细胞中次生代谢产物的含量成为可能，南方红豆杉组培体系的不断完善为进一步研究次生代谢产物的合成与代谢奠定了良好基础。细胞培养的最终目的是为了提高紫杉醇的产量，因此利用生物反应器替代摇瓶进行红豆杉细胞规模培养以及工业化生产就成为另一个研究热点和重点。目前，喜马拉雅红豆杉[17]、中国红豆杉[36-37]、欧洲红豆杉[17]、曼地亚红豆杉[38]和云南红豆杉[39]等均实现了生物反应器的大规模培养，部分并已投产[38]。但南方红豆杉细胞悬浮培养尚未实现生物反应器的大规模培养，还正处在研究阶段。另外，近几年来，国内外利用微生物发酵来生产紫杉醇的研究报道也不少，但目前利用内生真菌来产生紫杉醇的产量并不高，尚未能进行工业化。

南方红豆杉分子标记研究

近年来，随着分子生物技术的迅速发展，植物在蛋白质和DNA水平上的遗传多样性研究取得了突破性的进展，并在物种鉴定和濒危物种保护中得到广泛的应用。20世纪90年代以来，分子标记技术被广泛用于动、植物遗传育种、基因诊断、居群遗传学、生物系统学与进化研究上，如RAPD标记技术和ISSR分子标记技术，这2种分子标志均可揭示种间与种内的遗传多样性及其进化的亲缘关系（但后者比前者稳定性和重复性要好），可进一步为开展植物分子辅助育种、遗传转化及其转基因等方面的研究提供有价值的理论依据。2000年，王艇等[40]采用RAPD技术，在分子水平上对南方红豆杉的系统发育进行了探讨。2003年，张宏意等[41]通过随机扩增多态性方法对广东、湖南、江西3省的12个南方红豆杉自然居群进行了基因组DNA多态性分析，分析表明南方红豆杉居群间的遗传距离与这些居群的地理分布相关，相同或相邻产地的居群间的遗传距离较小，不同产地个体间的遗传距离较大。2005年，王贵荣等[42]通过对6个红豆杉种进行RAPD遗传多样性分析和染色体鉴定，得出南方红豆杉与中国红豆杉的遗传距离最小，西藏红豆杉与曼地亚红豆杉的亲缘关系最远，6个红豆杉种染色体数均为2n=24，为进一步保护和利用中国的红豆杉资源提供进化分子遗传学方面的依据。2007年，李振宇[43]根据cpDNA基因间隔区对南方红豆杉的种群遗传结构和系统地理进行了研究，同年，黄丽洁[44]采用叶绿体SSR技术对南方红豆杉的遗传多样性和遗传距离进行了研究，并认为南方红豆杉具有中等水平遗传多样性，不同地区间遗传分化小，种群和地区间基因流较大。2008年，茹文明等[45]通过RAPD技术对南方红豆杉8个自然种群的遗传多样性进行了分析，得出南方红豆杉种群濒危的主要原因不是其遗传多样性，而可能是由其本身生物学和生态学特性及其生存环境破坏所致的。为进一步探讨南方红豆杉濒危原因和对该物种的保护、进化潜力及种质资源利用等方面提供分子遗传学数据。2009年，张蕊等[46]利用ISSR分子标记对来自10省区15个南方红豆杉代表性种源进行了种源遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等方面的研究，得出了与上面相一致的结论。同年，张玲玲[47]通过RAPD和ISSR2种分子标记对福建省的南方红豆杉遗传多样性进行了初步研究，并对其RAPD和ISSR2种指纹图谱进行了比较分析。2010年，李乃伟等[48]采用ISSR标记技术对南方红豆杉迁地保护小种群及其衍生自然种群小斑块（小居群）的遗传多样性进行了分析。结果表明，南方红豆杉迁地保护各自然小居群间的遗传距离与其地理生境有关，而与其地理距离并无显著的相关性。2011年，李乃伟等[49]又对南方红豆杉野生种群、迁地保护栽培种群及迁地保护衍生种群的遗传多样性和遗传结构进行ISSR分析和比较，得出南方红豆杉迁地保护衍生种群的遗传多样性与野生种群接近，这为南方红豆杉的物种迁地保护提供了有力依据。

南方红豆杉基因工程研究

随着基因工程技术的不断成熟，植物基因工程在育种和研究天然活性物质生物合成的分子机制上起到了极大的促进作用，它能突破常规育种的局限性，加快变异速度，快速获得植株新品种。组织培养体系的建立与优化为南方红豆杉转基因的研究提供了基础和前提。目前，紫杉醇生物合成过程中的部分关键酶基因已成功克隆并进行了相关功能研究。2007年，燕丽娜等[50]以南方红豆杉的新鲜嫩叶中基因组DNA为模板，克隆测序得到紫杉烷7β-羟基化酶的全长基因，并对其进行了进化分析。2010年，肖颖等[51]以南方红豆杉愈伤中提取总RNA，成功得到紫杉二烯合成酶cDNA的全长序列，为南方红豆杉转基因做好了前期准备工作。同年，黄仕杰等[52]成功克隆了紫杉醇下游合成途径关键酶之一的紫杉烷13α-羟化酶基因，并对其进行了生物信息学分析，为利用代谢工程技术生产紫杉醇或其前体物质提供了分子基础。次年，程抒劼等[53]又成功克隆了能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10位的乙酰，从而生成紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体-巴卡亭Ⅲ的10-去乙酰巴卡亭-10-乙酰转移酶基因，这就为紫杉醇的进一步商业化生产奠定了基础。随着紫杉醇合成相关基因的一个个成功克隆，通过DNA重组技术获得产紫杉醇含量高的转基因植株即将成为可能。