菘蓝育种论文：生物科技在菘蓝育种的运用探究

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本文作者：程春松1，2彭代银1黄和平1郭友平1作者单位：1安徽中医学院药学院2中国中医科学院中药研究所

基本检测技术的应用

现代生物检测技术在药用植物的基源鉴定研究、转基因育种等各方面都有着广泛的应用，在菘蓝的育种研究PCR及RT－PCR技术、SouthernBlot分析、RAPD技术在外源基因检测、抗性基因的检测中取得了良好的效果。

1PCR及RT－PCR技术：1985年，KaryMul－lis发明了PCR技术，引用到药用植物育种研究中，可以通过分离植物基因来鉴定中药中的目的基因以及DNA指纹图谱研究。许铁峰等［11］为了验证外源基因是否转入植物细胞内，对抗生素抗性植株进行了PCR检测，对转基因菘蓝利用农杆菌介导外源半夏凝集素基因进行RT－PCR分析，由于PCR只能证明在转基因植株体内存在外源目的基因片段，而不能完全确定外源目的基因片段已整合进植物基因组，且PCR可能存在假阳性结果，因此通常配合采用SouthernBlot分析验证。

2RAPD与扩增片断长度多态性技术：1990年代提出RAPD技术，该技术现已广泛地应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究［16］。陈桂平等［12］选取同一个无性系植株及其亲本进行RAPD分析，得出结果无性系植株的遗传背景一致性很好，但也发生了DNA水平的变异。这项工作为进一步分离抗性基因和培育抗病品种打下基础。相对于RAPD技术，AFLP技术与之相类似，它是一项新的分子标记技术，能检测10倍的轨迹，并且可以检测任何DNA。

染色体研究技术的应用

药用植物染色体研究是分子生物学的基础研究，主要是包括总DNA的提取、染色体制片技术、核型研究以及其结构分析。

1菘蓝总DNA的提取：核酸样品质量将直接关系到实验的成败，所得的DNA应达到满足试验要求的量和纯度。陈桂平等［12］运用的菘蓝总DNA提取方法是采用改良的十二烷基磺酸钠微量提取法提取DNA。丁如贤等［10］采用改良十六烷基三甲基溴化胺法提取总DNA。CTAB是阳离子去污剂，可以很好地去除多糖，因此对于植物DNA的提取具有较高的广谱性，而SDS是阴离子去污剂，对多糖含量高的植物样品效果比较差。

2染色体制片技术：菘蓝染色体很小，因此，在测量长臂和短臂时，难以确定长、短臂的分界线，只有制作染色体分散、染色体分开，而着丝粒未分开的染色体标本，并把染色体相片尽量放大，才能较准确地确定着丝点的位置，使数据可靠［17］。杨飞等［18］在大麦、玉米染色体研究中多采用去壁低渗火焰干燥压片法，该方法简单易行，适合植物染色体制片。

3核型研究：核型是指染色体组在有丝分裂中期的表型，是染色体数目、大小、形态特征的总和。核型研究就是在对染色体进行测量计算的基础上，进行分组、排队、配对，并进行形态分析的过程。杨飞等的报道［18］表明：菘蓝的核型公式为2n＝2x＝14＝10m（2SAT）＋4sm，菘蓝核型的对称等级为2A，是一种比较对称的核型。鹿萍［17］报道二倍体染色体数为14条，核型公式为2n＝2x＝14＝14m，四倍体染色体数为28条，核型公式为4n＝4x＝28＝28m。以上研究基本确定了菘蓝染色体的数目、大小及形态特征。

4染色体分析：随着分子细胞遗传学技术的进步，荧光原位杂交技术被广泛应用于染色体识别和分析［19］。45SrDNA和5SrDNA是编码核糖体rRNA的基因，参与构建核糖体，已被作为十字花科核型进化分析及比较基因组学研究的重要细胞学标记［20］。杨飞等［18］为了深入研究菘蓝的分子细胞学特征，以45SrDNA、5SrDNA和端粒序列为探针，对菘蓝有丝分裂中期染色体进行荧光原位杂交实验，建立菘蓝荧光染色体核型。为菘蓝分子细胞遗传图谱的构建提供了必要依据。

组织培养技术

组织培养技术是药用植物育种过程中一项基本技术。客绍英等［21］以菘蓝幼叶为外植体，对其诱导培养过程中细胞启动、脱分化、组织分化和器官（芽和根）发生，进行了石蜡切片观察和分析。李连华等［22］以菘蓝愈伤组织为试验材料，分析比较了不同培养基对菘蓝愈伤组织增殖和分化的影响。此外张胜珍等［23］用纤维素酶和离析酶的混合酶液提取菘蓝无菌苗幼叶原生质体，他们探索了菘蓝原生质体分离和纯化的条件，为菘蓝的细胞工程育种做出了有效的探索。