诱导多潜能干细胞技术论文
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1iPSC技术
经典的iPSC技术路线主要包括以下步骤:①选择宿主细胞;②选择外源重组因子;③重组因子导入宿主细胞;④重编程产生iPSC;⑤iPSC的鉴定及分化。
1．1宿主细胞来源Yamanaka将小鼠体细胞诱导为iPSC开启了该技术的先河，之后人、大鼠、猴、猪、绵羊，甚至一些濒危动物的iPSC系纷纷建立。就人类而言，目前已从皮肤成纤维细胞、角质成形细胞、羊水、神经前体细胞、外周血细胞，甚至尿液中获得iPSC。不同组织来源细胞重编程效率及所需因子不同。不仅iPSC分化能力因人而异，在表观遗传稳定性和癌基因的表达方面也存在男女有别现象。使得iPSC技术应用于临床个体治疗更具挑战性。
1．2重组因子的选择及导入方式经典的Yamanaka因子在癌细胞中存在超表达、整合型载体可导致插入突变，且诱导效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于寻求更安全、简单、有效的诱导策略。Anokye-Danso等应用微RNA调控技术，不使用转录因子高效诱导iPSC。Zhou等和Kim等分别利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽与转录因子蛋白的融合蛋白，直接诱导受体细胞为iPSC，但效率较低。一些学者利用腺病毒、质粒载体瞬时转染靶细胞，或利用Cre/LoxP系统、oriP/EBNAI系统及piggyBac转座系统将外源基因整合后再特异性切除，从而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下现象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、维生素C、筛选激酶抑制剂、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的应用可显著提高iPSC的产生效率。
1．3iPSC的诱导分化Zhao等利用iPSC通过四倍体囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，证明了iPSC的全能性。目前，人们已成功地将iPSC在体外定向诱导分化为神经细胞、造血细胞、胰腺细胞、肝细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、耳蜗毛细胞、色素细胞等类型细胞。
1．4iPSC机制相关研究突破研究人员长期受困于体细胞重编程的具体机制。Polo等绘制出体细胞重编程为iPSC的分子线路图，证实诱导过程引起了两次转录波，分别是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驱动，并确定了重编程过程中路障基因。基于iPSC技术已证明细胞的分化过程并非不可逆转，研究人员利用细胞直接重编程技术将已分化细胞直接转化成特定谱系的细胞，利用间接谱系转化技术部分去分化生成多潜能祖细胞，为干细胞研究开辟了新思路。
2临床应用前景
iPSC因其分化全能性、体外易扩增、易于基因干扰或过表达等特性，在再生医学、药物研发评价、组织工程等领域有广泛应用前景。
2．1疾病特异iPSC动物疾病模型由于种属差异，不能真实反映人类疾病，利用疾病特异的iPSC系建立的iPSC疾病模型则可弥补这一缺陷，还可在免疫缺陷动物体内观察疾病。当前已建立包括神经系统疾病(帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、脊髓性肌萎缩、唐氏综合征、脆性X综合征)，血液系统疾病(范科尼贫血、镰刀细胞型贫血、β地中海贫血、原发性骨髓纤维化)，代谢系统疾病(1型糖尿病，Ⅲ型戈谢病，Shwachman-Bodian-Diamond综合征、肌营养不良、莱施-奈恩综合征)及其他疾病(右心室心肌病)等特异的iPSC系。
2．2药物研发及筛选大规模药物筛选需要很多细胞，iPSC可以无限增殖，并且疾病特异iPSC本身就是筛选药物的目标。Takayama等导入Foxa2及肝细胞核因子1α到人类ESC/iPSC产生具有代谢功能的肝细胞样细胞，对筛查药物肝毒性具有重大意义。Lippmann等将iPSC转化为血脑屏障的内皮细胞，可用于神经系统疾病药物高通量筛选或药物神经毒性检测。Egawa等利用肌萎缩侧索硬化症患者iPSC分化而来的神经细胞来筛选并确认药物效果，发现漆树酸具有改善神经异常的作用。
2．3组织工程学应用用干细胞培养的人体组织是理想的器官再造来源。英国已经报道利用3D打印技术为癌症患者重塑面部，Faulkner-Jones等将3D打印拓展到人ESC范围，当3D打印技术能够兼容iPSC时，组织工程学将迈上一个新的台阶。
2．4临床疾病治疗
2．4．1神经系统疾病帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，目前治疗手段只能改善症状。Kikuchi等利用iPSC分化出能产生多巴胺的神经细胞，然后移植到帕金森病猴子脑部，这些细胞存活半年以上，并持续释放多巴胺，很大程度上减轻了患病猴子的症状。Jiang等将帕金森病患者和健康志愿者皮肤细胞来源iPSC诱导为脑细胞并对比，观察到parkin基因发生突变产生自由基破坏多巴胺神经元是帕金森病发病机制之一。除帕金森病外，在阿尔茨海默病、脊髓侧索硬化症、脊髓肌肉萎缩症及舞蹈症等神经退行性疾病研究中，iPSC也取得许多进展。
2．4．2血液系统疾病Hanna等将人类镰刀型贫血症小鼠皮肤成纤维细胞建立的iPSC，通过同源重组技术获得正常基因型iPSC，诱导为造血干细胞并移植后可治疗动物模型的镰状细胞性贫血。Xu等用iPSC来源的内皮前体细胞和内皮细胞移植到血友病小鼠肝脏中，病鼠出血症状得到了改善。Raya等获得了基因修饰后的贫血症患者特异性iPSC，其能够分化成表型正常的髓系和红系造血祖细胞。最近，日本学者利用iPSC培养出一种能产生促红细胞生成素的细胞，有望用于治疗肾性贫血。
2．4．3心血管系统疾病2008年，Schenke-Layland等成功地将小鼠iPSC在体内和体外分别诱导出了心肌细胞。之后，Nelson等将iPSC分化得到的心肌细胞移植入具有完整免疫系统的成年小鼠梗死心脏内，能够观察到功能性的新生心肌。Tohyama等使用不含葡萄糖的低成本培养液获得大量纯度高达99%的心肌细胞，且几乎不存在癌化风险。而Zhang等证实iPSC具有分化为心房、心室和窦房结细胞等的潜能。
2．4．4感官疾病感音神经性聋的主要原因是毛细胞及螺旋神经节细胞退变和死亡，而其治愈需要相关结构的修复或再生。Nishimura等将iPSC来源神经祖细胞移植到小鼠耳内，观察到这些神经细胞开始表达谷氨酸神经元的标志性因子，表明iPSC可用于螺旋神经节损伤的再生修复。Oshima等使用小鼠ESC及iPSC成功分化出了功能性内耳毛细胞。Mizutari等使用γ-分泌物抑制剂抑制Notch信号通路，刺激支持细胞转变为毛细胞，首次证明成熟哺乳动物的感音毛细胞也能再生。感音毛细胞的损伤导致听力损失，感光细胞的损失则导致视力损失。Meyer等将iPSC分化为视网膜色素上皮细胞，成功治愈1例回旋状脉络膜视网膜萎缩症患者。Singh等将发育中的感光细胞移植到盲鼠眼睛中，能够再次形成视网膜的整个光敏感层，恢复视觉。
2．4．5内分泌系统疾病Tateishi等将正常人iPSC培养成胰岛素分泌型的胰岛细胞，其不仅能分泌C肽和胰高血糖素，而且能通过感受葡萄糖的刺激来调节C肽的分泌。Maehr等用1型糖尿病患者的成纤维细胞来源iPSC分化出了具有胰岛素分泌功能的细胞。这些研究使糖尿病患者特异细胞治疗成为可能。
2．4．6生殖系统疾病Park等将iPSC体外分化并分离得到原始生殖细胞，其与体内分离的原始生殖细胞在基因表达上极相似。Hayashi等将小鼠ESC和iPSC在体外诱导成为原始生殖细胞样细胞并分化为功能正常的精子和卵子。如果能进一步将人原始生殖细胞体外分化为精子和卵子，就有望治疗不孕不育症。
2．4．7运动系统疾病杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传病，患者早期即出现肌肉无力或萎缩，严重威胁生命安全。Filareto等将杜氏肌营养不良小鼠皮肤细胞重编程为了iPSC，进行遗传修复，再分化成骨骼肌干细胞进行移植治疗，能产生功能性肌肉，并检查到新形成的肌纤维表达修复后的标记，证明了iPSC技术结合遗传修复技术治疗杜氏肌营养不良的可行性。Diekman等利用iPSC在小鼠实验中培育出无再生能力的软骨，有望成为人造软骨组织的来源。
2．4．8肿瘤Chen等用小鼠iPSC培育出了癌症干细胞，并确认其发展成癌细胞的过程。Yang等发现人类iPSC来源的神经干细胞可以靶向肿瘤，或可用于联合基因治疗，抑制肿瘤生长。Vizcardo等从恶性黑色素瘤患者体内提取出T淋巴细胞，诱导出iPSC再分化成为T淋巴细胞，发现这些T细胞能够识别黑色素瘤特异性蛋白黑色素瘤抗原1，继续攻击癌细胞。此方法能够大量培养T淋巴细胞，有望在此基础上开发出治疗癌症的新型免疫疗法。
2．4．9其他人类疾病CCR5(C-Cchemokinereceptortype5)是人类免疫缺陷病毒进入靶细胞的重要辅助受体，缺乏CCR5使人类免疫缺陷病毒不能感染人体。Yao等用锌指核酸酶技术剔除患者iPSC的CCR5基因，并诱导成造血干细胞，为艾滋病的治疗提供一条新的可能途径。Arakaki等将小鼠iPSC与小鼠齿源性上皮细胞共培养，转化为成釉细胞，且含有作为牙釉质成分的成釉蛋白，这对牙齿再生和修复研究至关重要。
3展望
iPSC技术应用于临床前必须确保其安全性。目前存在的主要问题:iPSC带有自身表观遗传印记和端粒异常;与ESC相比存在少量基因异常表达;诱导本身及传代过程都可导致变异。而且自体iPSC移植回患者机体后会否引起免疫反应一直存在着争议。虽然存在各种疑惑和争论，但iPSC技术潜力不可限量，随着iPSC机制研究的进展，许多问题将迎刃而解，种种困难并不能减退人们对iPSC技术的研究热情，iPSC技术必将势不可挡地推动医学的发展。
作者：冯睡安广宇尹金淑单位：北京大学第九临床学院首都医科大学附属北京朝阳医院肿瘤科首都医科大学附属北京世纪坛医院耳鼻咽喉科
