肝脏组织工程脱细胞技术论文

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一、脱细胞支架制备方法

全器官脱细胞支架的制备是肝脏组织工程的基础，通过利用物理、化学或酶解等方法去除细胞成分和遗传物质，获得与原有器官相似的超微立体结构和大部分细胞外基质（ECM）成分，保留了完整的支架。1997年Cao等首次制造了人工耳，近年来脱细胞支架已运用于心、肺和肾等器官的组织工程研究，结果表明，脱细胞方案的选择与支架结构及ECM成分密切相关，具有器官／组织特异性。目前，应用于脱细胞支架制备的方法有很多，每种方法各有优势，其选择取决于组织的细胞结构、密度、脂肪含量和厚度。为方便科技工作者选择，对常用的脱细胞因子作如下简介。

1．化学因子（1）酸和碱：酸能水解生物大分子或催化其水解。过氧乙酸是一种常见的抗感染因子，对残留的核酸具有很强的去除作用，而对ECM的影响较小；乙酸会破坏胶原成分，降低ECM的强度，而对硫酸盐黏多糖的影响较小。碱因其完全去除了ECM中的生长因子，严重影响其机械性能，基本只用于早期处理表皮的脱毛。

（2）低渗和高渗溶液：高渗溶液可以分离DNA和蛋白质，低渗溶液可以溶解细胞。为发挥最大作用，经常将低渗和高渗溶液交替使用，但此法耗时长，处理后的组织易水肿，且不能完全溶解掉细胞残余物，还需进一步处理。

（3）洗涤剂：分为离子型、非离子型和两性离子型洗涤剂。通过溶解细胞膜并将DNA从蛋白质中分离，脱细胞效果明显，然而这些洗涤剂会将ECM中的蛋白质成分去除，蛋白质的丢失程度随着洗涤时间的增加而增加。多种洗涤剂同时使用会增加ECM蛋白的丢失，优点是有利于脱细胞之后洗涤剂的去除。与酶相比，非离子型洗涤剂TritonX－100能够更有效的从致密组织中去除细胞成分。离子型洗涤剂十二烷基磺酸钠（SDS）相比于TritonX－100能更好的从致密的组织或器官中去除细胞核成分，同时保持其机械性能；在完全去除细胞核成分中起至关重要的作用，但是会引起一些超微结构的破坏和生长因子的丢失。两性离子型洗涤剂3－［（3－胆固醇氨丙基）二甲基氨基］－1－丙磺酸（CHAPS）对薄的组织（比如肺）作用较强，但是对于较厚的组织，即使与SDS联合使用，脱细胞效果仍然很弱。需要注意的是，脱细胞之后必须将ECM中残余的洗涤剂去除，特别是SDS，它能够穿透入较厚和致密的组织，即使在较低浓度时仍对再种植的细胞显示毒性。

（4）醇类：甘油通过脱水和溶解细胞发挥作用；甲醇和乙醇能使蛋白质沉淀，进而破坏ECM的超微结构。

2．生物因子（1）酶：能够用于脱细胞的酶包括核酸酶、胰蛋白酶、胶原酶、脂肪酶、中性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和α－半乳糖苷酶，去除细胞成分方面有较高的特异性。然而，用单一的酶来完全去除细胞成分难以达到预期的目的，且残留的酶不利于细胞再种植，并且存在诱发不利免疫应答的可能。核酸酶可以裂解核酸序列，可用于去除残余的核苷酸。胰蛋白酶是一种常用的脱细胞因子，然而，ECM中的蛋白质如胶原蛋白对胰蛋白酶的抵抗能力较弱，因此使用时应格外小心。与洗涤剂相比，胰蛋白酶对弹性蛋白和胶原蛋白破坏力较大，脱细胞速度较慢，但能更好的保护糖胺聚糖。胰蛋白酶脱细胞效果及对ECM的影响程度与时间相关，单独使用胰蛋白酶完整脱细胞需要很长的时间。值得注意的是，胰蛋白酶可以破坏组织的超微结构，有利于后续的脱细胞因子的渗透，因此在初始阶段使用胰蛋白酶可以起到较好的作用，特别是要从一些致密的组织中完全去除细胞核。脂肪酶有协助去脂作用。中性蛋白酶的脱细胞效果较好，但会伴随着ECM更大程度的破坏。（2）非酶因子：螯合物如乙二胺四乙酸（EDTA）和乙二醇双（2－氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）有助于细胞从ECM蛋白中分离，但是，单独使用螯合物即使通过振荡也难以将表层细胞脱去。因此，它们经常和酶（如胰蛋白酶）或者洗涤剂联合使用。联合使用螯合物与高／低渗溶液脱细胞的效果尚不明确。3．物理和其他因子（1）温度：冻融技术能有效的溶解组织和器官中的细胞，对组织的超微结构仅有轻微影响。单次冻融可以减少不利的免疫应答，如白细胞浸润；应用多次循环冻融对ECM蛋白的含量影响较小。（2）机械振荡法和压力：机械振荡法可通过振荡产生的能量破坏细胞，多与其他方法联合使用，可将细胞从基底膜分离，然而不可避免的造成超微结构和基底膜完整性的破坏。静水压力所需时间较短，在血管或者角膜组织脱细胞时的效果比洗涤剂或者酶更有效，但是冰晶的形成会影响ECM的超微结构。（3）非热力学打孔技术：使用微秒的电脉冲流经组织或者组织中的剩余细胞，可以诱导产生细胞膜表面的微空隙，从而破坏细胞内微环境，继而导致细胞死亡。由于非热力学打孔技术的探针较小，能用它来脱细胞的组织较小，应用明显受限。

二、脱细胞支架的灭菌

脱细胞支架制备成功后将进行系列体内外实验，在此之前对支架的灭菌十分重要，常使用去除热原法来清除残余的内毒素、病毒和细菌DNA。生物支架可以置于酸或者其他溶剂中以达到灭菌的目的，但是该方法渗透能力不强，且会损伤重要的ECM成分；环氧乙烷对ECM的机械性能影响较大，并引起不利的免疫应答，进而影响移植后正常功能的发挥；γ射线、电子束辐射等灭菌方法会改变ECM的超微结构和机械性能；超临界二氧化碳对ECM和支架的机械性能的影响较其他方法小，目前成为一种替代方法。

三、肝脏脱细胞支架的制备方法

脱细胞器官优良的性能为其成功应用于肝脏带来希望。Shupe等首次报道了啮齿类动物肝脏的脱细胞，通过下腔静脉置管，门静脉切断，上腔静脉结扎，PBS去除血管内剩余血液，依次用浓度为1％、2％、3％的TritonX－100各300ml以5ml／min的速度灌注肝脏，以含0．1％SDS的PBS液300ml冲洗。脱细胞肝脏经HE染色，显示完整的ECM网状结构；免疫组化染色表明Ⅳ型胶原和层黏连蛋白均保留，且胶原存在于基质中，而层黏连蛋白存在于血管的基底膜中。将106个大鼠肝脏前体细胞WB344置于RPMI1640培养基中，通过置管的下腔静脉注入肝脏进行再种植，构建出组织工程肝脏。另有文献报道，经门静脉插管以1ml／min灌注梯度浓度的SDS（0．01％、0．1％、1％）各24h，用蒸馏水灌注15min、1％的TritonX－100灌注30min清除剩余的SDS。PBS冲洗1h后，从门静脉注入染色剂可以清楚地观察到完整的血管结构。将其中一叶置于0．1％的过氧乙酸中灭菌。组织学分析显示，在支架中几乎无细胞核结构；免疫组化分析Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、β1层黏连蛋白，结果表明其在ECM的结构和血管基底膜的完整性方面与正常肝脏相当，DNA含量分析证实支架中DNA低于3％。大鼠来源的肝细胞经门静脉以15ml／min灌入，3D动态培养2周，分别于种植后4h、1、2、5d行组织染色，结果表明4h时，大多数细胞存在于血管内或者血管周围，1d和2d时，细胞离开血管，分布到基质中。该文献首次报道了将肝细胞种植到支架上后白蛋白分泌、尿素合成等功能的发挥，再种植成功的肝脏被移植到单侧肾切除的大鼠体内。Baptista等采用小鼠、大鼠、雪貂、兔和猪，分别经由门静脉插入不同尺寸的导管，通过蠕动泵以5ml／min的速度注入总量约为40倍肝脏体积的蒸馏水，后以1％的Triton－X100和0．1％氨水灌注肝脏去除细胞，最后以蒸馏水去除残余洗脱剂。将人脐静脉内皮细胞和人胚胎肝细胞种植到肝脏支架中，同时通过门静脉以3ml／min循环灌注RPMI1640培养基16h，首次证实了人肝细胞前体细胞具有在脱细胞肝脏支架上生存的潜力。功能测定显示，培养液中的尿素和白蛋白水平明显高于单纯将人胚胎肝细胞置于培养液中的方法。另有文献报道一种改良的脱细胞方法，以RPMI1640培养基灌洗10min，再用混有SDS的磷脂酶A2冲洗30－60min，直到组织透明，流出液澄清，再以高渗盐水及核酸酶分别冲洗，直到灌洗液在280nm及260nm的吸光度皆呈阴性，最后以RPMI1640培养基冲洗2h，所制备支架具有将肝脏前体细胞分化成肝细胞和胆管上皮细胞的能力。然而，上述文献都仅限于啮齿类动物，Barakat等采用新的方法制备猪脱细胞支架，并进行人肝细胞种植：以SDS进行去细胞，右前叶作为种植细胞的支架，含有肝细胞生长因子的胚胎肝细胞和胚胎星状细胞作为种植细胞，灌注液中含有肝细胞生长因子和其他所需营养物质，通过测量灌注过程中氧分压、二氧化碳分压、乳酸、葡萄糖、尿素氮和白蛋白量进行肝脏代谢和合成功能的评估。结果表明，再生的肝脏呈现活跃的代谢能力，并保留白蛋白的合成能力，种植细胞分化为成熟的肝细胞。因此，ECM对于细胞的种植至关重要，具有支持细胞生长、促进前体细胞特异性分化的作用。Hammond等通过将肝脏脱细胞支架移植到正常肝脏和部分肝切除的肝脏中，证实了这一观点。首要的观察指标为肝细胞DNA的合成和肝组织渗透进入支架的程度；其次的观察指标为非实质细胞的DNA合成、肝重量的测定、肝功能测定以及移植物周边的细胞生长情况。结果令人振奋，支架种植到正常肝脏4d后，支架周边有更多的肝细胞增殖，7d后更多的肝脏组织渗透进入支架中；部分肝切除术后2d，种植支架的肝脏较单纯部分肝切除的肝脏有更多的肝细胞增殖。

四、前景与展望

将干细胞或者成熟的肝细胞种植到去细胞支架上，并在生物反应器中动态培养，是肝脏组织工程的基本思路。人或动物来源的全器官脱细胞支架因保留有完整的血管网状结构，有利于血管系统的再生及营养和氧气的运输，较人工合成支架有较大的优势。人源性种子细胞在理论上可以将免疫排斥反应降到最低。再生的器官移植到体内之前，必须明确细胞在支架上所能发挥的功能及生物相容性。此外，细胞与周围微环境间的作用机制、肝脏ECM对细胞活动的调节作用、相关生长因子所起的作用等，都将是去细胞组织工程肝脏未来研究的方向.

作者：邬迪单位：，南通大学附属医院普通外科