流式细胞技术论文

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1资料与方法

1.1一般资料

患者的入选是根据美国胸科协会制定的诊断指南，存在大于3周以上的咳嗽症状，有至少一条哮喘症状，并且体格检查出现相应体征的儿童患者随机纳入研究，研究时间从2012年1月～2014年6月。

1.2方法采用

流式细胞术。所收集样本冷冻保存，统一检测，末梢血样采集于肝素钠抗凝管中，取100μL血样加入中含有20μL白介素-3的缓冲液中，室温孵育10min，然后加入100μL儿童哮喘患者或健康对照组的血清，室温孵育20min，其中缓冲液包含0.12MNaCI，0.005MKCI，0.025MTris，pH7.6。N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP0.4mmol/L）（Sigma-Aldrich公司，圣路易，MO，USA），一种非特异性细胞活化剂，被用于阳性对照，洗涤缓冲液（0.01M磷酸缓冲盐水包括0.01M的磷酸二氢钠，0.01M磷酸氢二钠，pH为7.2～7.4）被用于阴性对照。孵育结束后将样品置于冷却的冰上防止嗜碱性粒细胞活化和降解，继而与荧光FITC结合的抗CD63抗体孵育BectonDickinson，FranklinLakes，NJ，USA），与荧光PE结合的抗IgE抗体（Pharmacia，Uppsala，Sweden），以及PerCP结合的抗CD45抗体（BectonDickinson）避光孵育20min，加入红细胞溶解液。2500rpm离心10min，将沉淀用缓冲液悬浮，BDFACSCantoⅡ流式细胞仪进行分析。在采集过程中，红色荧光（FL2）和前向散射（FSC）和侧向角散射（SSC）的特点是采用至少1000嗜碱性粒细胞的表达高IgE介导的面密度的选框进行分析，使用FSC/SSC特性淋巴细胞的定义。然后，从这些细胞，FL3/FL2图上嗜碱性粒细胞的认定为CD45低/IgE的高表达。

1.3统计学方法

使用SPSS®软件进行统计分析（SPSS公司，芝加哥，IL，美国）。x2检验用于比较患者组和对照组之间各个受体的表达情况。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

共纳入研究的哮喘儿童有72名，健康对照组32例。嗜碱性粒细胞的识别依赖表面受体的CD45的低表达和IgE的高表达，CD63的表达可用于识别嗜碱性粒细胞是否被患者或者健康对照组的血清激活。接受来自非过敏的健康志愿者的血清刺激后，抗FcεRI的自身抗体CD63的表达数目和比例如表1所示。29/78（37.2％）的哮喘患者血清表达CD63+的嗜碱性粒细胞，CD63+嗜碱性粒细胞的人数比例是为（36.9±8.3）％。与此相反，在健康组中的血清只有4/32（12.5％）对照表明CD63+嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞的“x±s”的比例人口，这是CD63+为（26.3±5.6）％。哮喘中的比重差患者与健康的比例。有CD63+嗜碱性粒细胞的对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。

3讨论

当前的研究表明高亲和性免疫球蛋白（IgE）和荨麻疹受体在哮喘症的发病机制发挥着重要的角色。使用流式细胞仪的嗜碱性粒细胞活化试验（BAT）表明，哮喘患者的在免疫荨麻疹（FcεRI）的自身抗体明显比正常人水平要高（分别为37.2%和12.5%），这与我们之前的研究是一致的。除了特异反应性之外，哮喘机制还包括气道反应性和相关的炎症。同时，自身免疫性疾病也是内因性哮喘的症状。高亲和性IgE受体FcεRI是一种多聚蛋白质的表面受体，在啮齿动物细胞中，以四聚物高分子的形式表达；在人体中以三聚物高分子的形式存在。而在肥大细胞和嗜碱粒细胞中，FcεRI则是IgE介质导致的急性过敏反应的结果。IgE高亲和受体FcεRI和多价体抗原的交叉感染可能导致肥胖细胞的活化，或者导致多种炎症中介的后续反应。此外，过敏和过高的自身免疫的部分原因可能来自于免疫系统的失调，而这恰恰可能导致荨麻疹和哮喘。因为这两种症状存在着某种的联系，比如一致的发病机制。在哮喘和自身免疫疾病中，通过观察肥大细胞，抗体，T细胞和细胞激素可以看到，免疫系统的调节原理和方法是一致的。因此FcεRI和IgE的自身抗原可能是哮喘的发病体制中的一环。另外，我们的研究表明，哮喘患者和健康对照组比较，FcεRI抗原引发的自身抗体阳性，更加支持了上述结论：自身免疫反应可能参与了哮喘的发病机制。

作者：饶冬东张福辉赵静毛剑芳单位：福建省妇幼保健院检验科厦门市妇幼保健院检验科