iPScs细胞技术论文
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1PD的环境及职业致病因素
1.1金属元素
有研究发现，某些重金属，比如锰的慢性中毒可损害中枢神经系统，特别是纹状体和苍白球等部位，产生类似PD的锥体外系神经功能障碍。Guilarte等及Huang的研究也发现锰中毒与PD有着密切的联系。Park发现电焊工及其他长期暴露于锰的工人存在着出现神经症状和罹患PD的危险性。Moberly等的研究还表明，锰可以通过作用于嗅球和基底神经节的多巴胺能神经元来影响神经介质的释放，从而导致PD等锥体外系疾病的发生。Coon等利用K-XRF技术测量了慢性暴露条件下铅在人体内的沉积量，并表明长期的铅暴露与PD发病风险成正相关。Komatsu等证实了锰、铁、铅、镉、铝等金属在体内的沉积会导致氧化应激的增加，从而引起PD的发生。
1.2农药百草枯
对多巴胺系统具有神经毒性作用，从而导致PD样症状和改变。Betarbet等利用鱼藤酮复制出了类似PD的大鼠模型，其症状包括出现震颤、步态不稳等。某些PD患者的脑组织中所含有机氯农药，如林丹、狄氏剂的水平明显高于对照组。代森锰（一种杀真菌剂）也被报道与PD的发生相关。还有研究发现，有机磷农药同样与PD的发病相关。
1.3环境毒素
1983年，美国有人吸食了含有1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）的海洛因后出现了典型的PD症状和病理学改变，研究者受到启发用灵长类复制了MPTP的PD动物模型。研究人员经过实验证实，MPTP对多巴胺能系统具有神经毒性从而导致PD样症状和改变。此后，MPTP的PD模型开始被应用于试验中。另外，Shepherd等发现，MPTP还可明显增强百草枯对多巴胺能系统的损害。
1.4其他因素
PD的发病还与很多种因素相关。有学者经过研究发现，摄入过多的脂肪，罹患PD的概率也会增加。Miyake等发现摄入花生四烯酸和胆固醇会增加PD的发生概率。Kyrozis等通过对希腊人饮食习惯的研究发现饮用牛奶也和PD发病有关。Kotagal等发现高血压等心血管危险因素与PD发生具有一定相关性。Aryal等还发现，四氢生物蝶呤（BH4）等增加会导致PD初期病情的恶化。Willis等发现居住环境与PD的发生也有一定关系。
2PD发病机制的研究手段及应用进展
2.1概况
当前的PD研究手段包括动物模型，细胞模型和ipscs模型等。动物模型为PD发病机制最早的研究方式。Maneuf等早在20世纪50年代就通过对啮齿类动物注射利血平的方法使其产生类似人类的PD样症状。此后研究者们又相继积极研发出了6-羟多巴胺模型，百草枯模型等。基因敲除和转基因小鼠模型在PD研究中也有应用。细胞模型包括肾上腺嗜铬瘤细胞系（pheochromocytomacells，PC12）细胞模型，SH-SY5Y细胞模型等。大脑结构复杂性的缺乏和较短的模型寿命意味着小鼠等动物模型难以详尽地阐释人类的疾病，细胞模型也并没有可靠地显示出在PD患者身上所观察到的缓慢的疾病进程。近几年，新兴的iPScs技术，将来源于PD病人的iPScs可分化为中脑多巴胺能神经元，在体外模拟其生理特性，可方便研究人员在更接近人体内环境的条件下研究PD的发病机制。
2.2iPScs技术的发展
iPScs技术是干细胞领域近几年来比较热门的一种新兴干细胞技术。该技术通过病毒载体或其他特异载体将特定转录因子的组合转入到被诱导细胞中，进而将已分化的体细胞重编程为未分化的多能细胞。2006年Takahashi成功将小鼠成纤维细胞重编程为与胚胎干细胞特征相似的诱导性胚胎干细胞，即iPScs。他利用逆转录病毒将4个与多能性相关的基因Oct-4、Sox2、Klf4、c-Myc组合导入被诱导细胞，再经过多能性分子Fbxl5筛选，从而得到在多方面与胚胎干细胞很相似的多能性细胞。随后成功诱导出iPScs。2008年Nakagawa研究小组使用了Oct3/4、Sox2、Klf43个基因，避免了原癌基因c-Myc的插入使得iPScs更安全化，利用Nanog代替Fbx15作为筛选标记，从而进一步提高了筛选的特异性。2009年，Woltjen研究小组以转位子为载体代替了逆转录病毒，所得到的iPScs避免了病毒基因的顽固表达和插入突变等风险，从而使得临床应用风险进一步大大降低。另外，直接将重组蛋白质导入体细胞以及利用合成mRNA进行转染等方法也显著降低了突变的危险性。有报道称体细胞可以通过小分子复合物而不依靠病毒来实现重编程。还有研究者发现毛猴素，二甲基五羟色胺和D4476可作为Oct3/4的化学替代品。随着研究的深入，iPScs技术愈加成熟，不断进展的诱导iPScs的方法既可有效消除重编程造成的种种潜在危险，又可以简单快速地获得iPScs。
2.3利用iPScs技术进行环境、职业致病因素
诱导PD发病机制的相关研究由于环境因素和遗传因素相互影响的复杂性，环境职业因素对PD作用相关的研究具有一定难度。Aboud等以无PD遗传危险因素者为对照组，以PARK2等位基因功能缺失且具有PD家族史但是还未出现症状者为实验组建立了观察锰神经毒性差异的iPScs模型。来源于实验组和对照组的真皮成纤维细胞的iPScs被分别诱导分化为早期神经神经前体细胞。经过测定发现两组神经前体细胞在对锰毒性的敏感性和线粒体分裂等方面几乎没有差别，但是实验组与对照组相比，活性氧显著升高。经过测定发现实验组与对照组相比，锰在细胞内的沉积明显减少，表明在锰沉积率相同的条件下实验组神经前体细胞对于锰毒性的敏感性比对照组高。但是锰沉积明显减少的原因是否与PARK2突变有关尚不清楚。Kikuchi等将人体iPScs来源的的神经前体细胞在无血清、无饲养层条件下培养至28d和42d后分别定向性植入MPTP处理过的猴子双侧豆状核，植入6个月后。磁共振成像（MRI）图像显示移植的细胞在猴子的大脑中存活增殖。由于MRI图像与猴子脑片苏木精-伊红染色的结果具有一致性，他们利用MRI来观察移植细胞的增殖情况。培养至28d的移植细胞增殖迅速，而培养至42d的移植细胞增殖相对缓慢。他们还发现移植后1~3个月的细胞倍增时间明显短于3~6个月，说明细胞的增殖能力在后期开始下降，但至少可以在猴脑内存活6个月以上。他们又通过描述行为评定量表发现移植后猴子的行为较之前发生了一些进步，表明人体iPScs在未来临床试验中的治疗潜力。Deleidi等通过逆转录病毒将人类KLF4，SOX2，OCT4和c-MYC导入恒河猴皮肤成纤维细胞，获得iPScs后进一步将其诱导为多巴胺能神经元细胞并植入6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的小鼠PD模型的纹状体，移植细胞在移植16周后进行组织分析发现具有酪氨酸羟化酶阳性细胞，且小鼠的纹状体中显示出神经的再生现象。他们还发现这些动物的同侧旋转行为等在移植后均有所恢复，而且移植6个月后这些小鼠既没有产生肿瘤，也没有发生炎症反应，进一步证实了iPScs在PD等神经退行性疾病在临床治疗方面的安全性。Chang等的研究证实了二十二碳六烯酸处理过的iPScs来源的多巴胺能神经元前体细胞植入到6-OHDA诱导的小鼠PD模型体内，小鼠的症状在4个月后得到了一定的缓解。Peng等将来源于iPScs的神经多巴胺能神经元建立起1-甲基4-苯基吡啶离子（MPP+）模型和鱼藤酮的PD体外模型，对44种可能对PD有治疗作用的药物进行了两轮筛选，并利用具有神经保护作用的神经营养因子作为阳性对照。经过MPP+的初筛和确认筛检，他们发现其中16种药物对于MPP+诱导的神经细胞死亡显示出神经保护作用，并利用MPP+模型建立起了这16种药物的剂量反应曲线。经过鱼藤酮模型的筛检他们更加明确了这些药物对于鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡确实具有一定的保护作用。这种方法可以应用于可能具有临床疗效的PD药物的检测来缩短药物进入临床的时间，并可增加临床实验成功的可能性和个体化治疗的可能性，为明确药物疗效提供了良好的平台。
2.4iPScs技术
面临的问题及展望iPScs可用来进行组织功能的研究和新药物的筛选，也可移植到人体内来治疗遗传或退行性疾病，而且还避免了免疫排斥及伦理问题。然而，iPScs技术应用在临床实践前，仍然面临着一些重要的挑战：（1）iPScs诱导方法仍存在诸多不足。例如用于重组病毒载体的某些重组基因是致癌基因，产生的iPScs临床安全性不能得到保障。（2）iPScs向神经细胞分化的过程中具有不一致性和低效率性。（3）衰老是否可以在iPScs来源的细胞中复制是在针对神经退行性疾病的研究中一个难以攻克的问题。尽管有着种种尚未解决的问题，利用iPScs作为神经退行性疾病的模型对于现代医学的研究有着很重要的影响。随着医学研究的深入和研究者们不断的实验和探索，iPScs技术将会得到更大的发展，在与小鼠模型、全基因测序、MRI等技术结合后，iPScs技术将在对PD等神经退行性疾病多方面的研究中起到举足轻重的作用。
作者：白莹徐斌单位：中国医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室
