细胞技术在泌尿系统疾病中治疗应用

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摘要：细胞膜片技术是一种无支架的组织工程技术，主要通过调节细胞的培养温度获取连接紧密的活细胞组织片与自分泌的细胞外基质，可以完整保留细胞表面的关键蛋白，如离子通道、生长因子受体、细胞间连接蛋白。由于无需外源支架材料，能够避免排异及伦理等问题，可有效弥补现有修复材料的不足。通过检索近5年的国内外公开发表的文献，发现细胞膜片被广泛应用于泌尿系统疾病的治疗中，其具有独特的临床转化前景，但截止目前尚未见相关主题的综述。细胞膜片在尿道与膀胱的修复、急慢性肾损伤、充盈性尿失禁等疾病中被证实有良好的治疗效果，但是缺乏进一步的临床试验研究。目前尚未检索到利用细胞膜片修复输尿管的研究报道。此外，在细胞膜片应用于临床之后即将面临细胞膜片的培养周期较长与择期手术的矛盾以及产业化问题。将来如何妥善保存成熟的细胞膜片以做到随取随用也是一项充满挑战的研究方向。

关键词：细胞膜片；组织工程；尿道修复；膀胱修复；尿失禁；肾损伤细胞膜片技术（cellsheettechnology，CST）

目前主要被应用于组织工程修复领域，具有广阔的临床应用前景[1,2]。近年来，利用质粒转染、基因编辑等技术对细胞进行改性后培养成细胞膜片，从而加强了其因子分泌功能或使其分泌新的细胞因子，也进一步拓展了细胞膜片的治疗手段[3,4]。在临床治疗中，干细胞膜片、上皮细胞膜片和心肌细胞膜片已分别在皮肤、角膜、中耳黏膜和心肌修复的试验中取得满意的疗效从而得以应用[5-10]。在泌尿系统疾病的治疗中，CST在临床研究中同样有良好的修复效果，临床应用潜力正在被不断发掘。因此，本文将主要阐述CST在泌尿系统疾病治疗领域内应用的研究进展。

1CST简介

近年来，尽管组织工程新型材料不断涌现并被应用于体内组织的修复再生，但可生物降解支架的降解产物引发炎症反应和排异反应的风险始终存在[11]。因此，CST被提出来作为一种替代方法。细胞膜片的经典培养方法是将目的细胞高密度接种于温度敏感型材料包被的特殊培养皿中，并添加相应的生长因子以维持细胞特性及促进细胞外基质分泌[12,13]。这种温度敏感型材料可以在低临界溶解温度下发生亲水相/疏水相的快速转变，即当外界培养温度由37℃降至20℃时，温敏培养皿表面的特殊材料可逆地变为亲水状态，发生快速水合和溶胀，完整的细胞膜片即可自动脱落，由此获得完整的纯细胞层片与自分泌的细胞外基质，离子通道、细胞因子感受器和细胞因子受体等成分被完整地保存，有利于维持细胞活性并减少细胞损失及凋亡。另一方面，与细胞膜片相比，同样不需要支架材料的细胞悬液注射疗法具有诸多局限性，例如需要借助溶质、细胞容易流失、细胞存活能力差、体内分布具有不确定性，可造成意想不到的副反应[14]，也无法将细胞定位于治疗靶点并发挥最大化的治疗效果，从而使其难以达到预期的治疗效果。

2CST在尿道修复中的应用

尿道下裂和不同原因引起的尿道狭窄是泌尿外科常见疾病[15,16]。由于缺乏理想的尿道修复替代材料，往往疗效不佳，尤其是针对超过3cm的长段尿道狭窄。处理长段尿道狭窄所面临的主要问题是寻找理想的修复替代材料[17]。传统构建组织工程尿道的方式包括单纯支架材料或细胞支架复合物修复尿道。然而有研究发现，单纯支架材料或细胞支架复合物修复尿道时，虽可诱导尿道组织再生，但随着体内移植时间的推移，部分修复段尿道由于支架材料的吸收导致挛缩感染等并发症的发生，在修复长段尿道缺损时尤为明显[18]。支架材料因组织相容性问题及炎症反应限制了其临床应用。虽然口腔黏膜或皮瓣移植已被临床广泛应用于尿道修复，并能适应尿液暴露环境，但口腔麻木、疼痛、尿道腔内皮瓣毛发的生长等问题始终困扰着患者与临床医生[19,20]，所以不需要支架材料的细胞膜片因为可以有效弥补以上不足而被广泛研究。而来源于膀胱或口腔培养的移植物或上皮细胞膜片也可作为一种备选方式，但其涉及到侵入性操作和额外的损伤区域，供区部位的并发症也常常给患者带来额外的痛苦[21]。皮肤上皮细胞膜片的培养和移植可解决上述缺点，它提供充足的上皮细胞，无毛发生长和微创伤，易从包皮或腹股沟区获取并兼顾美观需求。ROGOVAYA等[22]利用尿道损伤的新西兰兔模型，证明移植的皮肤上皮细胞膜片可以成功修复尿道。术后4~7d恢复自主排尿功能，尿道无瘢痕及异常瘘管形成。移植区域术后45d可检测到荧光标记和尿道标记物UP3共定位的皮肤上皮细胞。此外，细胞膜片的可操作性较强，可以根据实际需要进行排列复合形成具有3D结构的生物材料。ZHOU等[23]利用平滑肌细胞膜片、成纤维细胞膜片和口腔黏膜上皮细胞膜片成功构建了一种全层仿生尿道组织，经过体内预血管化后回植，成功修复犬3cm尿道缺损，首次从实验上证明了利用CST可以建立3层组织工程化尿道，并能促进再生的尿道形成与正常尿道相似的结构和功能。

3CST在膀胱修复中的应用

膀胱肿瘤、创伤、感染等疾病可引起膀胱功能丧失、容量减少。在膀胱部分切除或全切术后，膀胱扩大或重建新膀胱通常需要使用部分胃肠道以改善患者的生活质量。由于使用胃肠道组织材料可导致额外的手术创伤、术后电解质失衡、结石形成、尿路感染、黏液生成和恶性肿瘤发生等一系列并发症，因此组织工程细胞膜片作为一种无支架纯细胞材料正在被越来越多的研究用于膀胱重建。单层细胞膜片力学强度较弱，用于修复膀胱通畅时需要复合多层或与其他材料相结合以增加其力学强度。此外，若移植前经过充分的血管化可增加膜片的存活率。WANG等[24]利用多层脂肪干细胞膜片构建了一种生物工程3D膀胱补片，并在大鼠模型中评估了其用于膀胱再生的可行性，研究发现组织工程膀胱补片可以修复膀胱功能，促进尿路上皮、平滑肌、神经细胞和血管再生。GUO等[25]取平滑肌细胞和内皮祖细胞共培养，形成体外预血管化平滑肌细胞膜片，然后单层多次埋置皮下形成充分血管化的平滑肌组织瓣，最后用于修复膀胱壁肌肉缺损。该研究证实了预制地血管化平滑肌组织瓣具有可靠的膀胱重建潜力，为3D组织工程材料血管化提供了新的方法。WATANABE等[26]将比格犬口腔黏膜上皮细胞膜片贴于撕去黏膜的胃壁组织瓣上后进行膀胱重建，3周后取修复部位组织瓣行免疫组织学检查，发现口腔黏膜上皮细胞膜片均存活，新生上皮分层与口腔黏膜相似。

4CST在急慢性肾损伤（acutekidneyinjury,AKI）中的应用

AKI与肾小管坏死、炎症和血管损伤有关，发病率和死亡率很高[27,28]。据报道，间充质干细胞（mes-enchymalstemcells,MSCs）通过分泌促性腺激素、抗凋亡因子、抗炎因子和免疫调节因子以旁分泌方式减轻肾损伤[29,30]。PARK等[3]报道了一种使用基因编辑的人脐带间充质干细胞膜片改善大鼠急性肾缺血灌注损伤的方法。与体细胞来源的MSCs相比，脐带来源MSCs在快速增殖、多次传代后干性的维持、免疫调节功能等方面更具有优势。此外，由于AKI发生的突然性，损伤后制备自体细胞膜片在短时间内通常难以完成。在这种情况下，已经进行了预先质量控制可供同种异体移植的脐带MSCs可立即使用。PARK等[3]通过锌指核酸酶介导的基因组工程技术，编辑脐带MSCs增强血管生成因子和抗炎因子的分泌来治疗AKI。基因编辑后的脐带MSCs被培养成为细胞膜片，随后被贴附于脱去脂肪囊的AKI大鼠肾脏表面。结果表明早期使用细胞膜片疗法可以改善肾脏生理功能和组织病理损伤，并且基因组工程化的脐带MSCs细胞膜片组的治疗效果优于静脉内注射细胞悬液组。有学者指出，该治疗方法可能涉及包括全身麻醉、开腹、去除肾脏周围的脂肪组织甚至打开肾包膜、放置细胞膜片、关腹等过程，可能会进一步加重患者的创伤[31]。因此，在限定的临床适用范围内，细胞膜片疗法可用于计划性肾移植手术。肾移植过程本身会引起缺血再灌注损伤，细胞膜片能够分泌避免继发性损伤和免疫调节的相关因子，有望改善移植肾的预后[32]。肾脏纤维化是由慢性缺血和炎症以及储存尿液致肾小管内压力升高引起的[33]。在单侧输尿管梗阻（unilateralureteralobstruction,UUO）模型中，肾脏缺氧导致肾小管上皮细胞和肾成纤维细胞发生纤维化反应，随后加重缺氧，并最终导致进行性纤维化[34-38]。研究表明，外源性给予肝细胞生长因子（he-patocytegrowthfactor,HGF）具有肾脏保护作用[39]。HGF参与血管生成和血管舒张从而改善肾脏血流供应，还可以通过阻断转化生长因子-β（transform-inggrowthfactor-beta,TGF-β）信号通路来防止成纤维细胞增殖而抑制纤维化[40-45]。由于肝脏的灭活与消除作用，静脉用HGF半衰期约5min，最后仅有少量的药物作用于肾脏[46]。MASATOSHI等[4]首先报道将持续分泌HGF的细胞膜片贴附在肾脏上，用来治疗输尿管梗阻导致的肾纤维化。研究者将HGF质粒转染的胸膜间皮细胞膜片移植到UUO大鼠肾脏上，结果表明细胞膜片在体内可以持续分泌HGF长达28d，有效抑制了肾脏纤维化。

5CST在尿失禁治疗中的应用

压力性尿失禁（stressurinaryincontinence,SUI）是指在运动和咳嗽等引起腹压升高的情况下，尿液通过尿道的非自主渗漏。该疾病是一个存在于世界范围的疾病，影响所有年龄段的患者，常见于女性患者[47,48]。目前，轻中度SUI的治疗主要采用盆底肌肉训练、生物反馈训练和药物等保守疗法。严重的尿失禁通常需要外科手术干预，主要包括注射填充剂、植入吊带和植入人工尿道括约肌。注射填充剂是SUI的微创治疗方法，尤其适合要求低手术风险的老年患者。WANG等[49]利用脂肪干细胞膜片制备了一种脱细胞基质碎片填充剂，并证实了其治疗SUI的有效性。研究发现这种新型填充剂1周内与周围组织完全融合，4周后宿主平滑肌细胞已在注射区域内大量再生，形成新的平滑肌组织。研究认为，脱细胞基质碎片的结构蛋白和附着因子发挥了重要作用，是一种具有临床转化前景的微创治疗方法。ZOU等[50]则利用骨髓间充质干细胞膜片研制了一种组织工程化吊带用于治疗SD大鼠SUI。研究将40只雌性大鼠随机分为4组：A组假手术，其余3组均行双侧坐骨神经近端切断术造模，术后4周测漏点压力证实为SUI。B组不放置吊带；C组应用真丝吊带；D组应用细胞膜片组织工程吊带。结果显示，4周后，C组和D组漏尿点压力几乎达到A组的正常水平。12周后，D组胶原含量和最大拉力优于C组。研究者认为在大鼠SUI模型中，细胞膜片组织工程吊带形成了韧带样组织，提示其不但未被吸收降解，反而与宿主完全融合并能够长期发挥作用。作者认为先前的研究将骨髓间充质干细胞悬液直接接种在材料表面或水凝胶中，会导致细胞大量损失、不易存活。因此，将细胞接种在大孔或致密支架上形成细胞膜片再保留完整细胞外基质和细胞因子，还可以增加力学强度，卷曲折叠制成吊带后治疗SUI具有长期疗效。

6结语与展望

综上所述，细胞膜片是一项在组织工程修复领域具有广泛应用前景的技术。细胞膜片无需酶消化，可以直接收获具有自分泌细胞外基质的多层细胞薄片，完整地保存离子通道、细胞因子感受器和细胞因子受体等成分，有利于细胞活性的保持并减少移植后细胞的损失及凋亡，已在临床多个学科中成功应用。虽然细胞膜片在尿道与膀胱的修复中有大量的临床前研究，但是尚未进一步开展临床试验。截至目前，尚未检索到利用细胞膜片修复输尿管的研究报道。细胞膜片疗法用于治疗急慢性肾损伤的适应证范围及利弊仍然需要探讨与权衡。细胞膜片用于治疗尿失禁是一个新兴的研究方向，展现出良好的临床应用前景。此外，在细胞膜片应用于临床之后即将面临细胞膜片较长的培养周期与择期手术的矛盾以及产业化问题，将来如何妥善保存成熟的细胞膜片，做到随取随用也是一项充满挑战的研究方向。

作者：张东亮 单位：上海市第一人民医院