雪豆根腐病鉴定与其基因研究

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本文作者：向妮1,2段灿星1肖炎农2王晓鸣1朱振东1作者单位：1.中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程2.华中农业大学植物科技学院

0引言

【研究意义】豌豆是仅次于普通菜豆的第二大食用豆类作物，作为粮食、蔬菜或饲料来源广泛种植于世界各地[1-2]。在豌豆生产中病虫害的发生是影响豌豆产量和品质的主要因素。目前已报道有数十种病原菌可以侵染豌豆，其中由茄镰孢豌豆专化型引起的镰孢根腐病是最重要的病害之一[3]。茄镰孢豌豆专化型是一种顽固性的土传病原菌，豌豆种子萌发后就开始侵染子叶附着区、上胚轴、下胚轴和较上部位的主根。随后，侵染向上扩展到地面，向下扩展到根系，产生红褐色到黑色条纹病斑，随着时间的推移病斑合并，根部维管束变红褐色，导致植株矮化、发黄和基部叶片坏死[3]。镰孢菌根腐病一般导致30%—57%的豌豆产量损失，严重发生的地块减产可达60%以上[4-6]。豌豆在中国有2000多年的种植历史，全国范围均有种植，其中西北和西南地区是干籽粒豌豆主要产区，豌豆是这些地区的主要栽培作物之一[7-8]。

在中国，由镰孢菌引起的豌豆根腐病最早记载于20世纪50年代[9]，目前该病已在全国范围内普遍发生，特别是在甘肃、宁夏豌豆主产区危害严重，导致豌豆栽培面积大幅度减少[10-14]。

【前人研究进展】防治豌豆根腐病的有效途径是利用抗病或耐病品种[10,15-17]。抗病或耐病品种的成功选育有赖于对病原菌群体结构的了解。国外的大量研究表明，在农田系统中豌豆镰孢根腐病菌茄镰孢豌豆专化型存在极大的自然变异，并形成了复杂的致病基因型[18]。茄镰孢豌豆专化型对豌豆的专化致病性由豌豆致病基因（PEP）所控制。在茄镰孢豌豆专化型的一个超数染色体上存在一个豌豆致病基因簇，迄今在这个基因簇上鉴定了6个豌豆致病基因（PDA、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4和PEP5）[19-21]。在这6个豌豆致病基因中，PDA基因家族编码细胞色素P-450单加氧酶[19]，该酶能够降解豌豆产生的植物保卫素豌豆素（pisatin），降低其活性，因此又称作豌豆素去甲基化酶（PDA）[22-26]。所有自然发生的不含PDA的NectriahaematococcaVI（F.solani）分离物一般对豌豆都不具有致病性。因此，PDA是茄镰孢豌豆专化型对豌豆致病性的决定基因[22,27]。几个PEP的功能目前还不清楚，但是它们在基因簇上的存在可以提高病原菌分离物对豌豆的毒力水平[21,28]。最近，Etebu等[18]基于PEP基因簇基因的序列建立了检测PDA、PEP1、PEP3和PEP5的特异性PCR标记，用于快速检测土壤中茄镰孢豌豆专化型及其致病基因的多样性水平，并建立了土壤中茄镰孢豌豆专化型分子定量检测和病害流行预测的方法[4,29]。【本研究切入点】迄今，中国对豌豆根腐病研究很少，主要局限在病害的描述和病原菌分离鉴定，虽然在抗病品种的选育上取得一定进展，但是抗病育种工作完全是在自然发病的压力下进行抗性选择[10]。为了有效地开展抗病品种的选育，有必要对中国不同地区茄镰孢豌豆专化型种群进行深入了解。【拟解决的关键问题】本研究对中国10多个省（市）豌豆镰孢根腐病菌进行分离鉴定、致病力测定和致病基因检测，以便了解病原菌毒力及致病基因的多样性水平，为有效开展豌豆抗病育种提供理论支持。

1材料与方法

试验于2009年6月至2011年4月在中国农业科学院作物科学研究所完成。

1.1试验材料

豌豆镰孢根腐病植株及土壤样品为2009—2010年分别从甘肃、河北、宁夏、云省、福建、内蒙古、吉林、四川、安徽、青海和北京11个省（市、自治区）豌豆生产田采集。豌豆品种“草原27”由青海大学提供。

1.2试验方法

1.2.1病原菌分离

植株病样用常规组织分离法分离病原菌。取约5mm2的病组织，用2%的NaClO表面消毒2min，无菌水漂洗3次后，转入酸化的PDA培养基上，25℃培养，待菌落长出后，挑取菌落前缘菌丝至PDA培养基上，25℃培养。根据菌落特征和分生孢子的形态，参考Nelson等[30]方法初步进行镰孢菌分离物的鉴定。对疑似镰孢菌分离物进行单孢分离，获得单孢分离物。

土壤样品过筛后，取适量装入直径为10cm的塑料钵中，播种豌豆品种“草原27”，每钵5粒，盖上适量土样后，置于温室培养，必要时辅以光照和浇水。植株发病后，采用上述组织分离方法分离病原菌，对疑似镰孢菌分离物进行单孢分离。

1.2.2豌豆镰孢根腐病菌分子及形态学鉴定

将疑似镰孢菌分离物在铺有灭菌玻璃纸的PDA培养基平板上25℃培养5—7d，收集菌丝后用CTAB法提取基因组DNA[31]。用茄镰孢种特异性引物（ITS1-F(F)/AFP346(R)：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′/5′-GGTATGTTCACAGGGTTGATG-3′）对分离物基因组DNA进行PCR扩增[32]。反应体系为20μL，包括2μL10×PCRbuffer（200mmol•L-1Tris-HCl，200mmol•L-1KCl，15mmol•L-1MgCl2），1μL10mmol•L-1dNTP，上、下游引物（2μmol•L-1）各2μL，Taq酶1.25U，模板DNA20ng，水补足20μL。PCR反应扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，引物60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，Gelred染色后成像系统下观察扩增结果。将分子鉴定为茄镰孢的分离物分别接种到PDA和CLA培养基上[33]，在25℃培养3—7d后观察其小型分生孢子、大型分生孢子以及分生孢子梗的形态[34-36]。

1.2.3豌豆镰孢根腐病菌致病力测定致病力测定

参照Temporini等[21]的方法进行，并略作修改。将豌豆品种“草原27”播种于装有适量灭菌砂的直径为10cm塑料钵中，每钵5粒种子，温度控制在25℃左右，必要时辅以光照和浇水。播种后12d幼苗用于接种。将鉴定为茄镰孢豌豆专化型的分离物接种在PDA培养基上，25℃培养7d后，用直径为5mm的打孔器从菌落边缘打取菌丝块；用无菌注射器针头在植株幼苗茎基部扎一伤口，将菌丝块菌面朝下贴在伤口上。每个分离物接种5个植株，以接种PDA培养基的植株作为对照。接种后植株在25℃下保湿48h，然后转入温室培养，接种6d后调查结果并记载病斑长度。致病力评价采用Temporini等[21]的标准，病斑长度＜6cm为弱致病力，6cm≤病斑长度≤8cm为中等致病力，病斑长度＞8cm为强致病力。

1.2.4豌豆镰孢根腐病菌致病基因检测

茄镰孢豌豆专化型的分离物基因组DNA提取方法同上。利用PDA、PEP1、PEP3、PEP5等4个致病基因特异性检测引物对分离物基因组DNA进行PCR扩增，引物信息详见表1[18]。PCR反应体系为20μL，包括2μL10×PCRbuffer（200mmol•L-1Tris-HCl，200mmol•L-1KCl，15mmol•L-1MgCl2），1μL10mmol•L-1dNTP，上、下游引物（2μmol•L-1）各2μL，Taq酶1.25U（TianGen－12.5U•μL-1），模板DNA20ng，水补足20μL。PCR反应扩增程序如下：PDA和PEP3为95℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PEP1和PEP5为95℃预变性5min，94℃变性45s，55℃1min，72℃30s，5个循环之后，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃30s，30个循环后72℃延伸10min。PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，Gelred染色后成像系统下观察扩增结果。

2结果

2.1病原菌分离和鉴定

共分离得到203个疑似镰孢菌分离物。根据大型分生孢子及菌落特征初步确定150个分离物疑似茄镰孢。利用茄镰孢特异性引物对这150个分离物进行PCR鉴定，有120个分离物扩增出约100bp的茄镰孢特异性单一条带，确定这些分离物为茄镰孢。对120个茄镰孢分离物进一步进行形态学鉴定。结果表明，有96个分离物与Jung等[36]描述的茄镰孢豌豆专化型分离物的基本形态一致。在PDA培养基上这些分离物产生蓝绿色到浅黄色分生孢子座；小型分生孢子稀少，单胞，卵圆形或椭圆形。在CLA培养基上会形成多分枝的分生孢子梗，大型分生孢子成簇聚集，大型分生孢子脚细胞圆钝而厚，多为3个隔，宽度小于5μm，属于B型[34]。在PDA培养基上有厚垣孢子产生，产生于菌丝的末端或侧枝。

2.2致病力测定

96个茄镰孢分离物接种豌豆幼苗茎秆进行致病性测定。所有分离物对豌豆品种“草原27”都致病，在接种部位产生褐色病斑，并不同程度的向茎秆上下扩增。结合形态学、分子特征及致病性的结果，96个茄镰孢分离物被鉴定为茄镰孢豌豆专化型。根据病斑大小将96个分离物分为强、中等和弱致病力3种类型[21]。结果表明，有78个分离物为强致病力类型，占分离物总数的81.3%，10个分离物致病力中等，占10.4%，仅有8个分离物具弱致病力，占8.3%（表2）。河北、宁夏、甘肃、云南、四川、安徽、北京和内蒙古等地分离物的主要为强致病力类型（50%—100%），福建和青海分离物以中等致病力和弱致病力为主（表3）。

2.3致病基因PCR检测

用PDA、PEP1、PEP3和PEP5等4个致病基因的特异性引物分别对96个茄镰孢豌豆专化型分离物基因组DNA进行扩增（表2，图）。在96个分离物中，含PDA有89个，占分离物总数的92.7%，有92个分离物含有PEP1，占95.8%，含PEP3分离物有91个，占94.8%，只有44个分离物含有PEP5，占45.8%。96个分离物共产生10个基因型，分别为PDA+PEP1+PEP3+PEP5（A型）、PDA+PEP1+PEP3（B型）、PDA+PEP3+PEP5（C型）、PDA+PEP1（D型）、PDA+PEP3（E型）、PEP1+PEP3（F型）、PEP1+PEP5（G型）、PEP1（H型）、PEP3（I型）和PEP5（J型）。基因型A、B、C、D、E、F、G、H、I和J所含分离物数分别为41、45、1、1、2、1、1、2、1和1个，各占分离物总数的43.0%、47.0%、1.0%、1.0%、2.0%、1.0%、1.0%、2.0%、1.0%、1.0%；其中含有4个（A型）和3个（B、C型）致病基因的分离物数量约占总数的91%，这些分离物主要来源于安徽、北京、河北、内蒙、宁夏、甘肃、青海、四川等。含不同致病基因的分离物其致病力也不同，含有4个或3个致病基因分离物的致病力普遍强，而含有2个或1个致病基因分离物的致病力普遍较弱。此外，含有PDA的分离物（A、B、C、D和E型等）致病力普遍较强；不含PDA（F、G、H、I和J型）的分离物致病力较弱（表2）。

3讨论

豌豆根腐病长期以来一直是阻碍中国豌豆生产的主要因素之一。然而，豌豆在中国是一种小作物，病害问题很少被重视。20世纪80年代末以来，一些研究者对青海、甘肃和福建省等一些地区的豌豆根腐病病原菌进行了鉴定，发现引起豌豆根腐病的病原菌有茄镰孢、豌豆丝囊霉、链孢粘帚霉、尖孢镰、根串珠霉、立枯丝核菌、终极腐霉和壳二孢菌、丝葚霉等，其中多数报道认为茄镰孢是引起豌豆根腐病的主要病原菌[6,11-14]。本研究对不同地区来源的豌豆根腐病菌进行了分离鉴定，发现约60%的分离物为茄镰孢（未发表数据），通过系统地对分离物进行形态学、致病性及分子特征鉴定，首次在国内明确引起豌豆根腐病菌的茄镰孢为豌豆专化性。通过致病力测定发现，茄镰孢豌豆专化型分离物间致病力存在差异，但绝大多数分离物为强致病力类型，这些分离物分布在宁夏、甘肃、内蒙古、云南、四川等地，这一结果与这些地区豌豆根腐病严重发生相一致。西北及西南地区是中国干籽粒豌豆的主要生产区，但是豌豆主要种植在干旱的坡地，土壤肥力较差，且连年种植，这些条件有利于镰孢菌根腐病的严重发生[3]。

在农田系统中，自然发生的茄镰孢豌豆专化型存在丰富的毒力变异。茄镰孢豌豆专化型对豌豆的专化性致病性及致病力水平依赖于致病基因的存在和数量[18,37]。利用Etebu等[18]开发的特异性引物，笔者检测了中国不同地理来源的96个茄镰孢豌豆专化型分离物致病基因，发现有92.7%、95.8%、94.8%和45.8%分离物分别含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5。根据这4个基因在每一个分离物中的存在与否，96个分离物共产生10个基因组合，即基因型（或单倍型），其中含PDA+PEP1+PEP3+PEP5基因组合（A型）和PDA+PEP1+PEP3基因组合（B型）的分离物分别占总数的43.0%和47.0%，这些分离物分布在安徽、北京、河北、内蒙、宁夏、甘肃、青海、四川，表明中国茄镰孢豌豆专化型存在致病基因多样性的同时，致病基因型趋于单一。

在茄镰孢豌豆专化型中，不同致病基因存在与否和（或）不同致病基因组合决定每一个分离物对豌豆的致病力水平。Etebu等[18]利用开发的特异性PCR引物对15个茄镰孢豌豆专化型毒力不同的分离物所含PDA、PEP1、PEP3和PEP5致病基因进行检测，发现缺乏PDA的分离物对豌豆不致病或致病力弱，4个基因组合分离物具有强的致病力，其结果支持PDA是茄镰孢豌豆专化型对豌豆致病性的关键基因，PEP1、PEP3和PEP5能够加强茄镰孢豌豆专化型的致病力。

本研究结果与Etebu等[18]的基本一致，但也出现了少数例外，如含有PDA、PEP1和PEP3致病基因组合的BJ-4、NM-7和AH-17为3个致病力最强的分离物，分别含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5或PDA、PEP1和PEP3致病基因组合AH-15、DX-1和AH-1为弱致病力分离物。

含有PDA、PEP1和PEP3致病基因组合的分离物具有最强致病力的可能原因是这些分离物可能还含有PEP2和PEP4，或存在其它的致病机制。PEP2与PDA、PEP1、PEP5一样能够独立地使缺乏超数染色体的N.haematococca的非致病菌株产生对豌豆的致病性，是N.haematococca豌豆致病力的决定因子[20,38-39]。Etebu等[37]最新研究表明含有PDA、PEP1和PEP4基因组合的分离物也具有强的致病力。此外，N.haematococcaMPVI还存在一种对豌豆素的忍耐机制，称作对豌豆素非降解性忍耐，即产生一个专化性ATP结合性组件转运蛋白NhABC1提高其对豌豆素的忍耐[40]。

含有PDA的茄镰孢豌豆专化型分离物对豌豆只具有弱或中等致病力已有报道[21]。迄今，通过遗传研究已经鉴定了9个PDA基因PDA-1、PDA-2、PDA2、PDA3、PDA4、PDA5、PDA6-1、PDA6-2、PDA7，但是只有能够快速诱导Pda活性的基因PDA-1、PDA-2、PDA4、PDA5与对豌豆的致病力有关[26,41]。因此，根据含有PDA基因PDA-、PDAL和PDAH的不同，可以将茄镰孢豌豆专化型鉴定为3种表现型，第1类缺乏解毒豌豆素的能力（PDA-），第2类长时间豌豆素诱导后产生低水平的豌豆素脱甲基化酶（PDAL），第3类豌豆素快速诱导中到高水平的脱甲基化酶产生（PDAH）[22,24,42-43]。PDA具有高度的序列同源性[25,44-45]，应用PDA特异性分子标记，可以有效的检测出PDA的存在，但是不能有效的区分这些基因类型[18]。因此，笔者推测本研究中分别含有PDA、PEP1、PEP3和PEP5或PDA、PEP1和PEP3致病基因组合的弱致病力分离物AH-15、DX-1和AH-1所含有的PDA为PDAL类型，然而，确切结果必须对PCR产物测序和进行同源性比较才能够获得。

4结论

通过形态学、致病性和分子特征研究确定引起中国豌豆镰孢根腐病的病原菌为茄镰孢豌豆专化型。强致病力分离物为豌豆主要生产区的优势种群。致病基因检测发现中国茄镰孢豌豆专化型分离物存在10种不同致病基因型，其中含有4个基因组合和3个基因组合的分离物约占91%，这些分离物绝大多数具有强致病力（87.4%）或中等致病力（9.2%），不含PDA的分离物基本上都是弱致病力类型，表明致病基因的种类与数量决定茄镰孢豌豆专化型分离物的致病力水平。