西瓜炭疽病菌特征与药剂毒性测定
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本文作者：周文静1,2范鸿雁2,3何凡2,3王运勤2,3作者单位：1.海南大学环境与植物保护学院2.海南省农业科学院热带果树研究所
实验方法
1菌饼的制备。病原菌于PDA平板活化，28℃恒温培养3d后用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌饼。
2孢子悬浮液的制备。用5ml灭菌水洗脱培养6d的病菌平板，制成浓度为10×40倍镜视野下20～30个孢子的悬浮液。
（1）不同培养基对病菌菌丝生长的影响。参试培养基包括PDA培养基、PSA培养基、PDA+1‰酵母培养基、PSA+1‰酵母培养基、西瓜肉榨汁培养基、西瓜皮榨汁培养基、西瓜叶煎汁培养基、V8培养基、燕麦培养基、玉米培养基和胡萝卜培养基。将菌饼移入不同培养基平板中央，每处理3次重复，置于28℃恒温培养6d。分别于培养3、6d后用十字交叉法测量菌落直径。
（2）温度对病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。将接好菌饼的PDA平板分别置于5、10、15、20、25、28、30、35、40℃恒温培养，培养和测量方法参照“1．2．3．1”。用移液枪吸取孢子悬浮液滴于凹玻片上，并置于上述9个温度处理保湿培养，分别于培养6、12h后用1%棉蓝乳酚油固定后镜检孢子萌发率(分生孢子的萌发以芽管的长度超过分生孢子直径长度的50%为标准)，每次检查孢子300个，每处理3次重复。
（3）pH对病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。用1mol/L的HCl和NaOH溶液调节PDA培养基的pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10个处理，接菌饼于不同pH的PDA平板中央，培养和测量方法参照“1．2．3．1”。将孢子悬浮液调节成上述10个pH处理，培养和计数方法参照“1．2．3．2”。
（4）光照对病菌菌丝生长的影响。将接好菌饼的PDA平板置于连续光照、光/暗交替和连续黑暗3种光照条件下，培养和测量方法参照“1．2．3．1”。
（5）孢子致死温度的测定。用移液枪吸取1ml孢子悬浮液于无菌试管内，分别置于40、45、50、55℃恒温水浴锅中，每处理分别保持5、10min后取出迅速冰浴，将各处理的孢子悬浮液滴加于凹玻片上，培养和计数方法参照“1．2．3．2”。
（6）碳源和氮源对病菌菌丝生长的影响。采用基础培养基(Czapek培养基)［3］，分别用木糖、果糖、麦芽糖、阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、淀粉8种碳源等量替换基础培养基中的蔗糖;分别用硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、尿素6种氮源等量替换基础培养基中的硝酸钠。将菌饼接种于不同碳源、氮源培养基平板中央，以灭菌水为对照。培养和测量方法参照“1．2．3．1”。
4杀菌剂的室内毒力测定。每种药剂各选取5个浓度梯度。无菌条件下用灭菌水配制所需浓度梯度药液的50倍，PDA培养基温度降至50℃左右，用移液枪吸取不同浓度梯度的药液1ml加入到49ml的培养基中，充分混合均匀后倒入直径为9cm的培养皿中，制成不同浓度梯度的含药PDA平板，待凝固后接菌饼于平板中央，置于28℃恒温培养，每处理3个平板，以不含药的PDA培养基作为对照。培养6d后用十字交叉法测量各处理菌落生长直径，计算菌丝生长抑菌率。
5数据处理。采用DPSv7．55软件对数据进行统计与分析。
结果与分析
1西瓜炭疽病菌的生物学特性
（1）不同培养基对病菌菌丝生长的影响。参试的11种培养基中，病菌菌丝在西瓜叶煎汁培养基中生长最好，培养3和6d后菌落平均直径分别为4．08和6．58cm;菌丝在西瓜肉榨汁和V8培养基中生长也较好，培养6d的菌落平均直径分别为6．33和6．30cm;其次为PDA培养基、西瓜皮榨汁培养基、PDA+1‰酵母培养基、PSA+1‰酵母和PSA培养基;菌丝在玉米、胡萝卜培养基上生长较差，培养6d的菌落平均直径分别为5．40和5．36cm;菌丝在燕麦培养基上生长最差，培养3和6d的菌落平均直径分别仅为3．38和5．31cm(图1)。
（2）温度对病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。在PDA平板上，病菌菌丝在10～35℃范围内均能生长，但在不同温度条件下菌丝生长差异变化很大。随着温度升高，菌丝生长速度加快，以28℃最利于菌丝生长，其病菌培养3、6d后菌落平均直径分别为4．15和6．31cm，极显著优于其他处理温度;当温度低于15℃或高于30℃时则不利于病菌菌丝生长;当温度低于5℃或高于40℃时病菌菌丝停止生长(图2)。病菌孢子在10～40℃条件下均可萌发，其中当温度低于5℃时分生孢子不能萌发，随着温度升高，孢子萌发率也随之升高，以28和30℃为孢子适宜萌发温度，培养12h后其萌发率分别为89%和92%，而当温度高于30℃时孢子萌发率明显降低(图3)。
（3）pH对病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。病菌菌丝在pH为3～12时均能生长，当pH小于4时菌丝生长明显受到抑制，pH在7～9时最适宜病菌菌丝生长，但pH为5～12时菌丝生长差别不明显(图4)。病原分生孢子在pH为3～12时均能萌发，分生孢子最适萌发pH为6～8，其分生孢子培养12h后的萌发率分别为91%、92%和91%，pH较高或较低均不利于孢子萌发(图5)。
（4）光照条件对病菌菌丝生长的影响。在不同光照条件下病菌均能生长，其中连续黑暗条件最利于菌丝生长，培养3、6d后菌落平均直径分别为4．06和7．10cm;其次为光暗交替条件，培养3、6d后菌落平均直径分别为3．45和6．38cm;连续光照条件下菌落生长最慢，培养3、6d后菌落平均直径分别为3．03和6．08cm。
（5）病原孢子的致死温度。分生孢子经55℃水浴处理5min后，再经凹玻片保湿培养48h仍不能萌发，孢子丧失活力。因此，确定病原孢子致死温度为55℃水浴处理5min。
（6）碳源和氮源对病菌菌丝生长的影响。在参试碳源中，麦芽糖、阿拉伯糖和葡萄糖作为碳源的基础培养基较适合病菌菌丝生长，而在以木糖、乳糖和可溶性淀粉为碳源的基础培养基上菌丝生长较差(表1)。在参试氮源中，病菌菌丝在含酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨的基础培养基上生长较好，而以硫酸铵、硝酸铵和尿素为氮源的基础培养基则不利于菌丝生长(表2)。
2不同杀菌剂对西瓜炭疽病菌的室内毒力
各供试药剂质量浓度对数与生长抑制几率值之间均表现为直线相关，回归达到显著水平(P＜0．05)。12种供试药剂对西瓜炭疽病菌均有抑制作用，不同药剂的抑菌效果存在差异。32．5%苯甲嘧菌酯SC、50%咪鲜胺锰盐WP和10%苯醚甲环唑WG对西瓜炭疽病菌菌丝生长均有很好的抑制效果，其EC50分别为0．0180、0．0602、0．4715μg/ml;其次为25%溴菌腈WP、25%吡唑嘧菌酯EC、40%福•福锌WP和75%百菌清WP，其EC50在15．4681～83．5292μg/ml;20%腈菌唑ME、50%醚菌酯WG、80%代森锰锌效果较差，其EC50在127．5780～213．2863μg/ml;而50%多菌灵WP和70%甲基硫菌灵WP的抑菌效果明显低于其他10种药剂，其EC50分别高达3495．3852和8286．8753μg/ml(表3)。
结论与讨论
(1)对西瓜炭疽病菌的生物学特性研究表明，西瓜炭疽病菌菌丝在西瓜叶煎汁培养基上生长最好，在西瓜肉榨汁及V8培养基上生长也较好。菌丝在10～35℃范围内均能生长，以28℃最适合菌丝生长，孢子萌发的最适温度为30℃，这与王汉荣等［6］对浙江省长瓜炭疽病病菌生物学特性研究所得结论“菌丝最适生长温度为25℃，孢子萌发最适温度为25℃”有差异。菌丝在pH为3～12时均能生长，以pH为7～9最适合菌丝生长，孢子萌发的最适pH为6～8。病菌菌丝在连续黑暗条件下菌落生长最快。病菌分生孢子致死温度为55℃处理5min。在供试碳源中，病菌菌丝在含有麦芽糖、阿拉伯糖和葡萄糖的基础培养基上生长较好;在供试氮源中，病菌菌丝含酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨的基础培养基上生长较好。笔者认为温度过高或过低、酸性环境都会影响菌丝生长和分生孢子的萌发，且不同的碳源、氮源亦会影响病菌菌丝的生长。了解西瓜炭疽病菌的生物学特性，对预防该病的发生具有指导作用。
(2)笔者不仅选用西瓜生产上常规药剂，还选用一些新型杀菌剂，进行了西瓜炭疽病菌的室内毒力测定。结果表明，在参试药剂中32．5%苯甲嘧菌酯SC、50%咪鲜胺锰盐WP、10%苯醚甲环唑WG均表现出很好的抑菌效果，为进一步田间防治西瓜炭疽病提供了参考;但50%多菌灵WP、70%甲基硫菌灵WP的EC50分别高达3495．3852、8286．8753μg/ml，这与胡育海等［7］的研究结论“50%多菌灵WP和70%甲基硫菌灵WP对西瓜炭疽病菌的室内EC50分别为1．7510和62．3213μg/ml”有较大差异。试验中，多菌灵等苯并咪唑类药剂多次室内毒力测定结果皆不理想，分析可能原因有:①多菌灵、甲基硫菌灵等苯并咪唑类药剂作为常规杀菌剂，长期大量使用，易产生交互抗性［8］;②海南地区由于病害种类多且高温高湿环境利于病害的高频率发生，因而较频繁地施用广谱、效果较好、价格低廉的该类药剂，如海南省分离得到的芒果炭疽病菌中已出现对苯并咪唑类杀菌剂有较高抗性的菌株［9－10］。
(3)由于得天独厚的地理及气候优势，海南省已成为我国新兴的商品西瓜产区之一及反季节西瓜生产基地，具有十分显著的经济效益和社会效益。然而，西瓜炭疽病的流行趋势日益严重，在生产和运输上造成的危害和损失不容忽视。该研究结果为进一步开展的西瓜炭疽病田间药效试验提供了理论依据。
