西瓜果斑病菌存活期测定

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本文作者：李艳嫦1孔静月1吴九玲2王琳3任小平3刘琼光1作者单位：1.华南农业大学资源环境学院2.广东省海丰县农业局3.广东省农业厅植检站

材料与方法

1供试菌株

西瓜细菌性果斑病菌野生菌株Aac1和抗利福平菌株RifAac，均由华南农业大学植物细菌研究室提供。

2培养基

Aac扩大培养培养基（普通培养基）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，水1000mL，pH7．4～7．8。Aac分离培养的培养基：参照改良ASCM培养基［11］并略作修改。KH2PO40．5g，K2HPO4•12H2O2g，（NH4）2SO42g，酵母膏10g，MgSO4•12H2O29mg，CaCl251mg，Na2MoO4•2H2O25mg，琼脂20g，水1000mL，灭菌后每1L培养基中加入溴甲酚紫0．6mL（15mg／mL），氨苄青霉素20mg，新生霉素10mg，放线菌酮25mg，无水乙醇10mL，pH7．0～7．2。Aac富集培养基（普通液体培养基）：除不含琼脂外，其成分与普通培养基相同。牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7．4～7．8。

3人工模拟接种

1）健康种子。将新红宝西瓜品种的健康种子（由广东省农业厅提供）分成3等份，每份500粒，取2等份浸入1×109cfu／mL的抗利福平RifAac菌液中1h，在自然条下室内晾干后，分别转入灭菌胶袋中，1份接菌的种子放置在室温下，另1份接菌种子置于4℃冰箱保存；接无菌水的那份种子也置于4℃冰箱保存，作为阴性对照。定期分离和检测种子上Aac存活情况。2）土壤。将种植过水稻、番茄、烟草和塘泥等不同来源的普通土壤各5kg均匀混在一起，经PCR检测不带西瓜果斑病菌Aac，将混合土装入洁净盆钵中，每盆装土15kg。设无病残体土壤和有病残体土壤（每盆埋入新红宝西瓜藤和瓜皮约500g）。将活化后并培养48h的RifAac菌液，调整菌液浓度约1×109cfu／mL，2009年9月30日进行人工接种。每盆接种200mL菌液，以不接菌为对照，随后淋自来水使土壤保持湿润状态。3）田水。田水取自室内盆栽水稻盆钵中的水，掺入自来水，每盆10kg田水，接种200mL菌液。将接种后的盆钵置于露天开放的自然环境中，期间定期浇自来水，以保持土壤一定湿度。定期分离和检测土壤里Aac存活情况。

4Aac的分离

分别采用直接分离、菌落PCR和常规PCR3种方法对人工接种的Aac进行检测，若能直接分离出Aac，则不进行富集培养；若不能直接分离出Aac，则进行富集培养后再分离，获得的单菌落进行菌落PCR（Bio－PCR）；若富集培养后无法再分离得到目标菌，则提取样品DNA进行常规PCR检测。定期分别取人工接种的种子10g、土壤10g和水10mL，研钵内碾碎后，加入100mL无菌水，进行10倍梯度稀释，各取50μL均匀涂布于含100μg／mL利福平的ASCM选择性平板上，30℃下培养3～4d，观察RifAac菌株生长情况。如果直接分离不到病菌，则先将样品于Aac富集培养基培养24h后，再用选择性平板分离。将上述选择性平板上获得的单菌落进一步PCR验证。

5Aac的PCR检测

菌落PCR和常规PCR采用Aac的特异引物分别为WFB1（5′－GACCAGCCACACTGGGAC－3′）和WFB2（5′－CTGCCGTACTCCAGCGAT－3′）［12］，PCR片段大小为360bp。西瓜种子DNA、土壤DNA和田水DNA的提取采用试剂盒方法进行，试剂盒PowerSoilTMDNAIsolationKit购自MOBIO公司。TaqReactionBuffer10×（2．5U／μL），TaqDNAPolymerase（2．5U／μL），dNTPMixture（2．5mmol／L），购于天根生化科技有限公司。采用25μL的PCR反应体系：10×PCRBuffer2．5μL，dNTPs2μL，WFB1引物1μL，WFB2引物1μL，模板1μL，Taq酶0．4μL，ddH2O17．1μL。反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min。PCR产物在1．0％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

结果与分析

1Aac在种子上的存活期

采用人工接种抗利福平RifAac菌株，每隔1个月左右对种子进行选择性平板直接分离、Bio－PCR以及提取种子DNA检测，以确定种子中的Aac存活情况。RifAac菌株在含利福平的改良ASCM培养基选择性平板上的菌落灰白色、圆形、光滑、隆起、不透明，直径1～2mm。分离结果表明，接种90d后，采用选择性平板能分离出Aac（表1），接种120d直接分离不到Aac，但富集培养后菌落PCR能检测到病菌（图1），150d后室温保存的种子3种方法都检测不出Aac，而低温保存的种子只有种子DNA能检测出（图2），180d后常规PCR检测不到Aac，说明在低温条件下保存种子中的病原细菌存活时间比室温长，至少能存活4个月。

2Aac在土壤和田水中的存活期

1）分离检测。直接分离法从模拟接种土壤、病残体土壤和田水3种场所中分离，并在ASCM选择性培养基上获得的疑似单菌落，通过PCR检测验证，证实为Aac活菌。结果表明，田水中1个月后直接分离不到Aac，2个月后Bio－PCR能检测到，3个月后，田水中PCR检测不到病菌。接种后3个月的病残体土壤和无残体土壤中都能分离到Aac，4个月Bio－PCR能检测到Aac。2）PCR检测。由于Aac在自然环境中易受环境因素和其他微生物的影响，人工模拟接种后，Aac在3个月后数量减少，用常规分离培养方法灵敏度有限，无法直接分离或富集分离出目标菌Aac，因此，本试验进一步选用灵敏度更高的PCR检测方法，观察Aac在环境中的存活情况。采用试剂盒方法提取土壤细菌总DNA，用Aac特异性引物PCR检测不同场所中Aac的存活情况。从接种后的第4个月起，提取供试土壤DNA进行PCR检测。结果表明，接种后第8个月没有病残体的土壤中仍然检测到Aac，在第10个月则检测不到；在接种含病残体的土壤中12个月之内均能检测到Aac，表明Aac在病残体土壤中的存活期更长，至少可达12个月，带菌土壤中的Aac存活期可长达8个月（图3）。

讨论

大量的研究结果表明，西瓜细菌性果斑病主要通过种子传播，因而病害防治的策略重点应在选用无病种子或种子处理［13－14］。尽管如此，西瓜种子的药剂处理除了存在环境污染外，仍然不能完全清除种子上的病原菌［14－16］。Shirakawa等［17］认为，如果西瓜种子中只要有1个菌落形成单位的Aac，在适宜的环境条件下就可以导致幼苗的发病，因此明确病原细菌在种子上的存活期，对于指导种子处理具有重要参考价值。本试验通过筛选抗利福平的RifAac菌株，人工接种西瓜种子，定期检测不同环境条件下病原菌在种子中的存活情况。结果表明，接菌30、60、90d后，直接分离、Bio－PCR都能在西瓜种子中检测出Aac，但接菌120d后，只有Bio－PCR和提取种子DNA的方法才能检测出Aac，150d后室温和低温保存的种子Bio－PCR都检测不到Aac，但低温保存的种子DNA能够用PCR检测出Aac，说明Aac在种子上常温下至少可以存活4个月，4℃低温下至少可存活5个月。然而，Shirakawa等［17］的研究结果表明，Aac在种子中4℃下可以存活更长时间，其原因可能是由于研究方法和取样的不同所致。Shirakawa等观察的是田间感染了病菌的种子，病原细菌可能已经侵入到种子内部；本试验是通过人工接种，病菌可能都在种子表面，其存活期可能没有在种子内部时间长，这个推测尚需进一步研究证实。此外，带菌的种子散落在田间后，长出的西瓜植株、残留在田间的染病瓜皮和田间可能带菌的葫芦科杂草等，都是感染下茬西瓜的重要菌源［2］，但该病菌是否可以在其他杂草或土壤中残存，其存活期的长短还不清楚。尽管有文献记载，病菌在埋土中的西瓜皮上可存活8个月，在病残体上可存活24个月［18］，但缺乏试验证明，目前尚未取得一致认同。本试验通过人工模拟接种，结合选择性分离、Bio－PCR和常规PCR方法，观察了Aac在无植物残体土壤、含病残体土壤和田水中的存活情况。结果表明，Aac在田水中只能存活2个月，在含病残体的土壤中可存活12个月。尽管病菌存活期时间的长短与病残体分解的程度有关，但本试验结果表明，Aac在不含残体的土壤中存活期可达8个月。西瓜细菌性果斑病初侵染源除了种子之外，还有土壤、病残体、其他杂草和寄主［19］。采用不同越冬菌源的Aac和接菌方法进行致病力试验，结果表明病果浸出液、干病叶、湿病叶和带菌土壤越冬后的菌源都有致病力，且以带菌土壤和干存越冬病叶越冬的菌源致病力较强［20］。选择无病西瓜种子是西瓜果斑病防治的关键，生产上应根据实际情况，特别是对表面污染了病菌的西瓜种子，可选择合适的方法对种子进行灭菌处理。如果种子不作任何处理，则务必要确保西瓜种子中果斑病细菌已经死亡或无危害性。此外，深耕翻土、清除田间带菌残株、土壤消毒、土壤闲置或与非寄主作物轮作12个月以上，结合防止田间灌溉水污染等措施，均能有效降低西瓜细菌性果斑病的初侵染来源，控制西瓜果斑病的发生和流行。因本试验采用人工模拟接种的方法，在不同接种体或场所上接种的病菌浓度和场所的放置环境与大田情况可能不同，故研究结果仅为西瓜果斑病的防治提供参考。有关西瓜细菌性果斑病的其他初侵染来源，如杂草或其他植物等，还有待进一步研究。