莲种质遗传特性分析
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本文作者：欧阳冬梅1刘凰1徐金星2刘春华2邹东旺1杨良波2唐记平1谢克强1作者单位：1.江西广昌县白莲产业发展局2.广昌县白莲科学研究所
我国是莲的原产地之一，莲在我国不仅栽培历史悠久，而且分布广泛，且是最具特色、栽培面积最大、品种资源最丰富的水生经济作物[1]。迄今为止，中国拥有花莲品种资源800多个[2]，藕莲品种和子莲品种资源分别数十个。莲是常异花授粉植物，不同品种间的基因交流很容易通过昆虫的授粉来完成，导致品种间遗传资源的混合和品种内的遗传差异较大[3]。目前，我国莲同种异名现象时有发生，同一地区品种单一化现象严重，大大增加了莲栽培的风险性。为了避免这一现象，选取了40份代表性品种（材料）进行SRAP遗传多样性分析，以期明确它们的遗传背景，探讨全国各地主要传统型品种与广昌县现有栽培品种的关系，从而为莲品种选育提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验所用40份莲品种（材料）为国内外莲主要产区在20世纪初期广泛应用于生产的优异材料。材料取自广昌县白莲科学研究所博览园内。这40份材料包括野生莲、全国各地传统品种、广昌县现栽培品种和花莲品种，材料详细信息见表1。
1.2样品制备
采集莲幼嫩叶片置于塑料袋中（自封袋），再加入变色硅胶，摇动使叶片与硅胶充分均匀接触。一般来说，硅胶与叶片质量比应为10∶1，以保证叶片在12h内干燥，一旦发现硅胶从深蓝变为粉红，及时更换硅胶，干燥的叶片材料在室温下保存即可。
1.3DNA的提取
选取上述硅胶干燥的叶片30mg，用液氮磨成粉状，再用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA。DNA质量检测用1%的琼脂糖凝胶进行，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压100V，电泳30min。
1.4SRAP分析
PCR扩增反应总体积为15μL，反应混合液中包括：50ng/μLDNA模板1μL，10×PCRbuffer1.5μL，10mmol/LdNTPs0.6μL，10mmol/L上下游引物各0.5μL，2U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，不足部分用无菌水补充。PCR扩增反应程序为95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃1min，5个循环；95℃1min，50℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min，温度降到4℃即完成扩增。扩增产物加上10μL的上样缓冲液94℃预变性5min，采用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE缓冲液，65W恒功率电泳1.5h。银染检测电泳结果。
1.5SRAP数据处理
对各莲材料各引物扩增情况作统计，有带记为无带记为0，缺失记为2。作矩阵图输入计算机，应用平均距离法进行聚类分析，并采用NTSYS-pc（Version2.1）软件处理，建立聚类图。
2结果与分析
2.1多态性分析
从40对SRAP引物中筛选出11对扩增稳定、多态性适中的引物对这40份材料进行扩增，11对引物共扩增产生184条带，平均每个引物对扩增出16.7条。其中多态性条带127条，多态性频率为69.0%。不同引物对多态性频率差异较大，多态性频率最高的为EM14+ME10和EM11+ME10，为100%，多态性频率最低的为EM9+ME10，为52.6%（表2）。
2.2指纹图谱的构建
以“0”“1”和“2”分别表示扩增的“有”、“无”和“缺失”，将11对多态性引物产生的127个多态性位点进行排序，形成一个数据距阵（表3），建立品种计算机化的DNA指纹，以区分供试品种（材料）。结果显示，每一份种质都有自己独特的指纹图谱。
2.3聚类结果
根据这11对多态性引物的扩增结果，经NTSYS-pc聚类分析，得出品种（材料）间的聚类图（图1）。结果表明，各品种（材料）间相似系数在0.68～0.93。其中以雪湖贡莲和马当莲的相似系数最大，为0.93，说明它们之间的遗传差异很小。在相似系数为0.79的位置，可将参试品种分为三大类。第Ⅰ类包括大部分野生莲品种和一个花莲品种（桌上莲）；第Ⅱ类包括泰国野生莲Ⅳ、Ⅵ，传统子莲品种和一个子莲花莲兼用品种（星空牡丹）；第Ⅲ类为花莲品种。另外，从聚类图上还可以看出，各种质材料的聚类结果与地理位置有一定的联系，来自同一个地方的种质除个别外（如泰国野生莲Ⅳ和Ⅵ），大部分都聚在了一起。这反映出同一个地方的品种材料的亲本可能相同或者相近，表明同一地区品种单一化程度较高。
3小结与讨论
SRAP（特征序列扩增多态性），以全基因组为靶标，通过设计的引物对ORFs进行扩增，上游引物对外显子进行特异性扩增，下游引物对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。与其他分子标记相比，该标记具有简便、稳定、中等产率的特点，是一种较理想的分子标记[4，5]。本研究利用11对SRAP标记基本区分了40份莲品种材料，证明了SRAP标记应用于莲种质资源鉴定的可行性。雪湖贡莲和马当莲相似系数为0.93，可能由于供试品种之间很相似，或是因为供试品种较多，而可用的SRAP引物有限，两者的特异性条带较少，使这两个品种未能很好地分开。莲在我国栽培历史悠久，依据其利用目的已明显演化为三大类群：子莲、藕莲和花莲。在本研究中，40份莲品种材料也分为三大类，与园艺学分类系统相吻合[6]，说明莲三大类型之间遗传分化十分明显。本研究中来自全国各地的野莲材料表现为叶片厚实、花无或少量、不结实或瓣化，在农艺性状上与藕莲极其相似，生产上习惯将它们划分为藕莲品种，泰国野生莲Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，在农艺性状上也与藕莲相似，在聚类图上得到了证实，与野生莲聚在了第Ⅰ类群。而泰国野生莲Ⅳ和Ⅵ在农艺性状上与子莲相似，表现为花多且结实，在聚类图中与传统子莲品种聚在第Ⅱ类群。这说明泰国野生莲品种之间遗传背景差异较大，在利用这些野生莲品种进行育种时，需根据育种目标的不同，选择不同的材料做亲本。同时也说明，分子鉴定应该与形态学分类相结合，两者互相佐证，才能在分类上更加准确可信。我们还发现本研究中的40份莲品种材料表现出很强的地域相似性，与前人的研究结果相似[7]，这说明来自同一个地域内的品种分化程度低，遗传多样性不丰富，极易造成品种单一化，在生产上需多加注意。在本研究中，古代莲和野生莲聚成一类，古代莲是考古出土的千年古莲子萌发繁育的后代，野生莲生长在自然湖泊中，很少有人工驯化积累的变异，而藕莲在长期的栽培过程中，只以产藕为驯化目的。野莲分布很广，前人一致认为野莲是现在栽培莲的共同祖先，根据聚类结果，野莲与藕莲的遗传差异相对较小，暗示藕莲可能是由野生莲直接驯化而来[8]。
