剖析白菜不结球的分子方法

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1材料与方法

1．1材料

利用江苏省农业科学院蔬菜研究所十字花科项目组不结球白菜研究材料T青做父本进行转育，得到F1代。2011年春，将双亲及F1代种植于江苏省农业科学院蔬菜研究所实验田。对F1代植株进行自交，得到F2代，F1代单株与不结球白菜亲本回交，得到BC1代。田间管理按常规方法进行。

1．2方法

1．2．1T青、结球白菜抗源CR、F1、F2及BC1。每个材料3次重复，每次重复30株，随机排列，播种于50孔穴盘。待苗长到3～4片真叶时移栽营养钵，采用灌根法进行抗性鉴定。用移液器吸取1ml含5×107或1×108个孢子悬浮液10ml，浇注到寄主根际周围，接菌6周后，洗净根部泥土，调查单株发病情况，并计算病情指数。田间病情分级参考前人研究分级标准［3］，略有改动。分级标准为:0级，未发生病害;1级，根系的须根、侧根有较少细小肿瘤，主根未发生病害;2级，根系的须根肿瘤多，侧根肿瘤较多，主根发病较轻，微微肿大;3级，根系的主根发病较重，异常肿大，大部分须根、侧根肿瘤多;4级，根系的主根异常肿大，根系几乎无须根。0级为抗病，其他均为感病。

1．2．2抗感池的构建及引物筛选采用BSA法，在F2群体中分别随机选取10株抗病单株和10株感病单株，将其DNA等量混合，构建抗病基因池和感病基因池，对引物进行筛选，挑选在抗、感病池间能够产生特异性条带的引物。

1．2．3PCR产物点入含0.5μg/mlEB的2.0%琼脂糖凝胶中，以DNAmarkerV(Tiangen)作为分子量标准，在2．0%琼脂糖凝胶中电泳1h，紫外凝胶成像仪下照相。

1．2．4ISSR标记的连锁分析将筛选出的ISSR标记在双亲及F2分离群体中进行验证，用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。亲本为抗病有标记带和感病无标记带，F1代为感病有标记带，F2代中重组型个体为抗病无标记带、杂合感病无标记带和纯合感病有标记带，根据F2代中重组型单株的数量计算交换率，再根据Kosambi作图函数公式换算成Morgan遗传距离。

2结果

2．1F1共接种30株，表现为高抗根肿病(抗性等级为0级)。F2随机选取73株，54株表现为高抗(抗性等级为0级)，其他感病(1株病级为1级，2株病级为2级，16株病级达3级)，抗感分离比为54∶19，满足3∶1(χ2=0.074＜χ20．05=3.84)。BC1随机选取70株，36株表现为高抗(抗性等级为0级)，34株感病(2株病级1级，1株病级2级，31株病级达3级)，抗感分离比为36∶34，满足1∶1(χ2=0.057＜χ20．05=3.84)。分析各病级范围内的单株频数，未发现4级病害的单株。表明该根肿病的抗性受显性单基因控制。

2．2分子标记的筛选用90条ISSR引物进行亲本PCR扩增，其中21条ISSR引物可以在亲本间稳定扩增出清晰多态性条带，占总引物数的23.0%。将能够扩增到清晰多态性条带的引物在抗感池中筛选，结果发现，引物873(5''''-GA-CAGACAGACAGACA-3'''')可以在抗感基因池中扩增出多态性条带，差异片段分别约为500bp。由于抗根肿病基因是显性基因，如果标记与抗病基因紧密连锁，纯合抗病株和杂合抗病株都能扩增出此带，而纯合感病株应没有此带。利用F2分离群体中的73个单株DNA对候选引物进一步验证，结果显示，标记873在54份高抗根肿病单株(抗性0级)中，53个扩增出差异条带，1个未扩增出差异条带。同样19份感病单株中，有6份扩增产生特异条带。因此共有7株在标记873与抗病基因之间发生重组，交换率为9．59%。依据Kogambi图函数公式得出标记873与抗根肿病基因之间的遗传距离为9．72cM，命名为CR-873。

3讨论

在B．rapa中发现了至少3个主要的根肿病抗性基因，这些基因是相对独立的，且分别对不同的P．brassicae生理小种发生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群体发现了B．napus根肿病抗性由1个主效基因和至少2个隐性基因控制［15］。王芳展等认为，B．rapa大多数抗性基因都来自于欧洲饲料芜菁，不同的品种获得了1个或者多个的抗性基因，而这些基因之间又相对保持独立［16］。本研究通过对抗根肿病多世代群体进行抗性鉴定表明，不结球白菜抗性由显性单基因控制。Matsumoto等发现了2个RFLP标记与1个CR基因CRa连锁，并将其定位在R3染色体34cM的位置上［17］。Suwabe等利用SSR标记，发现了Crr1和Crr22个CR位点［18］。Kuginuki等利用Siloga作为抗源，发现了3个RAPD标记与CR位点连锁［19］。ISSR技术可以比RFLP、SSR、RAPD等技术更多地揭示基因组中的多态性，并比RAPD稳定，比AFLP简便，是一种很好的DNA指纹标记。本研究采用BSA和ISSR技术相结合来研究与不结球白菜抗根肿病基因连锁的标记，得到1个与根肿病抗性基因连锁较紧密的分子标记CR-873，遗传距离为9.72cM。本研究中得到的CR-873标记与抗根肿病基因的遗传距离仍然较远，可能是因为本研究中用于计算遗传距离的群体偏小，一定程度上影响遗传距离的准确性。后续研究可以进一步扩大群体并把获得的可能与抗根肿病基因相连锁的ISSR标记转换为更稳定的SCAR标记。

作者：刘蓝单位：河北省农业局