探讨大麦遗传多样性的功用

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本研究以栽培青稞品种(系)为材料，采用IT－ISJ标记技术分析了该标记在大麦中应用的可行性，并评价了这些材料间的遗传关系，可为大麦育种、品种鉴定、新品种保护与利用提供依据。1材料与方法1.1实验材料供试材料共34份，包括西藏材料9份(XZ1－XZ9)、甘肃材料5份(GS1－GS5)、四川材料5份(SC1－SC5)及9份青海材料(QH1－QH9)和6份国外材料(AB1－AB6)。其名称及来源见表1。这些材料现保存于四川农业大学大麦研究中心。1.2方法1.2.1gDNA的提取。gDNA提取采用CTAB法［6］。

每份材料取新鲜健康的幼叶约300mg，置于液氮中迅速研磨至粉末，随后将粉末转移到2ml离心管中，加入800μL65℃预热的2×CTAB提取液［0.2mmol/LTris－HCL(PH约8.0)，0.02mmol/LEDTA，55mmol/LCTAB，2%β－巯基乙醇)］于65℃水浴至少50min，期间轻轻颠倒混匀几次，取出离心管冷却至室温，然后加入800μL氯仿:异戊醇(24:1)轻摇10min后静置30min，11000r/min离心15min，取上清液加入等体积的异丙醇沉淀DNA，用70%乙醇冲洗2次，90%乙醇再冲洗1次，干燥后加入50μl灭菌的ddH2O，用紫外分光光度计检测其浓度与质量。将DNA稀释至20ng/μL于－20℃保存备用。1.2.2IT－ISJ反应体系。PCR引物(表2)采用郑靓等［2］已发表的引物，由上海英捷贸易有限公司合成。引物组合以正反向引物名称的最后两个字母组合表示。PCR扩增通过正交试验设计选出最佳体系，总体积20μL，包括20ng/μL模板DNA2μL，1.5mmol/L的MgCl2，0.2mmol/L的dNTPs，0.5μmol/L引物，1UTaq聚合酶，2μL10×PCRbuffer。在PTC－200扩增仪上完成。反应程序为:94℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸lmin，40个循环，72℃延伸10min，4℃保存。1.2.3扩增产物的检测。扩增产物加3×Loading-Buffer10μL，95℃变性5min后，用预热30min的8%变性聚丙烯酰胺凝胶恒功率75w电泳，至指示剂离胶板底部三分之一处(约45min)，取下胶板。采用银染法检测［5］。用数码相机拍照，统计带型。1.2.4数据的处理。对IT－ISJ扩增产物的电泳结果采用0、1、－9统计建立数据库，在相同迁移位置有带记为1，无带记为0，模糊不清或其他原因记为－9。

遗传多样性指数(H)按H=1－∑Pi2(Nei等，1979)［7］计算，其中Pi为某座位第i个等位变异的频率。利用NTSYS－pc统计分析软件计算遗传相似系数(GS)。计算公式为:GS=2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij为材料i和j共有的扩增片段数，Ni为材料i中出现的扩增片段数，Nj为材料j中出现的扩增片段数。2结果与分析2.1引物组合筛选用10个正向引物和12个反向引物组成的120对引物组合，对选取的两个品种(北青2号、北青3号)进行多态性筛选，其中74对引物能扩增出条带，占引物组合总数的61.67%。有55对引物组合能扩增出多态性，多态性比例占45.83%。并用相同引物对和模板进行多次扩增和电泳，其带型没有变化，表明IT－ISJ标记在大麦上具有较好的重现性。从这55对引物中选取扩增性较好、重复性较高的20对引物对所有材料进行多态性分析，统计在100～2000bp之间能够清晰可辨的电泳条带。其中，引物组合IT－ISJ02F47R可区分11个品种，而引物组合IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能区分10个品种。特别是可用5个引物组合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能将本试验中的34份材料区分开，占引物组合总数的25.00%。2.2多态性分析图1为引物组合IT－ISJ05F18R扩增产物部分电泳图。发现不同的引物对扩增的条带数、扩增带型都不同(表3)。从表3看出，在总样本中，20对引物组合共产生清晰可辨的条带数为1～8条，大部分在4条以上，总计87条，平均每个引物对4.35条，其中81条具有多态性，平均多态性条带为4.05条，多态性条带为93.10%。在这20对引物中，3个引物对IT－ISJ02F18R、IT－ISJ11F46R、IT－ISJ05F18R的多态性条带比率分别为50.00%、60.00%、71.42%，其余17对引物的多态性条带比率为100%。这表明IT－ISJ标记适合于对大麦进行DNA多态性分析。2.3等位变异与遗传相似性从表3可知，20对引物共扩增出134个等位变异(带型)，变幅在2～11个，平均每个引物对检测到6.70个。34份材料间的遗传相似系数(GS)变幅在0.437～0.931之间，平均为0.743±0.094。其中，l来自墨西哥的CI－424(AB4)和北青3号系选的SC5间相似系数最小(0.436)，而北青1号(QH2)和北青2号(QH3)间相似系数最大，达0.931。

供试材料中，相似系数＜0.75的材料组合有238个，占组合总数的42.42%，相似系数＞0.75的材料组合有323个，占所有供试组合的57.58%。材料间平均遗传距离较低，仅为0.257，遗传多样性在0.2509～0.8460之间，平均为0.59。这表明供试材料间的遗传差异较小。3讨论与小结IT－ISJ(introntargeredintron－exonsplicejunction，内含子－外显子拼接位点)DNA分子标记技术是近年来由郑靓等(2008)［2］开发出的，具有多态性高、稳定性好、引物设计简便、操作简单、成本低等优点，已在陆地棉［2］、花生［3］、苹果［4］上有报道。但该标记应用于大麦上还未见报道。

在本研究中，我们首次用IT－ISJ的10个正向引物和12个反向引物组成120对引物，对选取的2个青稞品种(北青2号、北青3号)进行了引物对的筛选。筛选出多态性较高、带型丰富、条带清晰的引物组合55个，占引物组合总数的45.83%，远高于纪君超等(2010)［4］在加工苹果品种中报道的结果。从55对引物组合中选取20对引物组合对34份青稞品种(系)进行了多态性分析，共扩增出87条带，其中多态性带81条，平均每对引物组合扩增出4.05条带，多态性百分率为93.10%。而多态性高达100%的引物组合数达17个，占85.00%，明显高于郑靓等(2008)［2］在陆地棉、于树涛等(2009)［3］在花生上及纪君超等(2010)［4］在苹果中所得结果。在这20对引物中，3个引物对IT－ISJ02F18R、IT－ISJ11F46R、IT－ISJ05F18R的多态性条带比率分别为50.00%、60%、71.42%。从图1和表3看出，不同的引物对扩增的条带数、扩增带型都不同。引物组合IT－ISJ02F47R可区分11个品种，而引物组合IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能区分10个品种。特别是仅用5个引物组合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能将本试验中的34份材料区分开，占引物组合总数的25.00%。

上述结果表明，采用IT－ISJ引物组合对青稞品种(系)能扩增得到条带清晰、稳定性较好、多态性较高的条带、且操作简单、成本较低，这表明IT－ISJ标记应用在大麦上是可行的，将在大麦遗传多样性分析、品种鉴定，遗传图谱构建及分子标记辅助选择育种中得到广泛的应用。34份材料间的遗传相似系数(GS)变幅在8大麦与谷类科学BARLEYANDCEREALSCIENCESNO.4.20120.437～0.931之间，平均为0.743±0.094。供试材料中，相似系数＜0.75的材料组合有238个，占组合总数的42.42%，相似系数＞0.75的材料组合有323个，占所有供试组合的57.58%。材料间平均遗传距离仅为0.257，平均遗传多样性为0.59。这表明供试材料间的遗传差异较小，遗传基础较窄，遗传关系较近。因此，大麦育种者在杂交育种中应广泛发现和挖掘优异青稞资源，扩大青稞种质的遗传基础，提高青稞育种效率。

作者：余春磊刘家娴齐国昌罗小娇刘新春冯宗云单位：四川农业大学农学院植物遗传育种学系大麦研究中心四川甘孜藏族自治州农业科学研究所