柞树猝死病菌研究

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本文作者：程衬衬淮稳霞姚艳霞赵文霞作者单位：中国林科院森林生态环境与保护研究所

栎树猝死病菌Phytophthoraramorum是一种危害性极大的病原菌，隶属于藻界Chromista，卵菌门Oomycota，卵菌纲Oomycetes，霜霉目Peronospora-les，霜霉科Peronosporaceae，疫霉属Phytophthora。其寄主范围十分广泛，危害多种林木和花卉，造成栎树和石栎等树木死亡以及杜鹃、荚蒾等花卉枝叶枯萎。病菌最早于1993年在德国和荷兰有枯萎症状的杜鹃花和荚蒾分离得到。1995年美国加利福尼亚州栎树大面积死亡，分离到的病原菌，经生物学和核酸分析研究证明，这2种菌为同一种疫霉。由于疫霉多分离于土壤和水流中，很少在木本植物枝干上分离得到，2001年由欧洲学者将其定名为P．ramorumsp．nov．［1］，即“枝干上的疫霉”。该病菌因在美国引起栎树等树木突然死亡(SuddenOakDeath，简称SOD)而闻名，故常常称为栎树猝死病菌。病害在美国栎树和石栎树上的暴发，致使加州中部沿海的几个城市和郊区森林公园中的成千上万株树木短时间内迅速枯死，引起了世界各国广泛的关注和警惕［2］。

1病原菌生物学性状

1．1病原菌交配型

Phytophthoraramorum为异宗配合型真菌，具有两种交配型Al和A2，只有当Al和A2交配型共同培养才能完成有性生殖［1，3］。以往交配型的测定是通过交配型已知的菌株与待测菌株杂交以观察其性器官的形成。这种方法比较耗费时间而且不是非常可靠，一方面有些菌株并不在培养基里交配，另一方面，只有少数菌株测定了交配型。基于P．ramorum交配型基因的分子诊断测定方法还没有取得进展，因为这些疫霉属的基因很少被了解，并没有被克隆或者测序［4］。但是，北美洲以及欧洲种群的线粒体基因型看起来能充分区分两种交配型，因为所有的EU1世系都是A1交配型(少部分例外)，而NA1和NA2世系均为A2交配型。BoutetXetal．通过致病性分析表明，EU1×EU1交配产生的单卵孢株之间具有较大的变异性，超过50%的后代对杜鹃花叶片的侵染能力要小于亲本，然而EU1×NA1交配后代和它们的亲本之间却没有明显的差异［5］。Brasieretal．研究表明，两种交配型具有相同的寄主范围，同一种菌株对不同寄主的致病力似乎是相同的［6］。

1．2病原菌无性系

无性系是指单一基因型的所有无性繁殖个体［7］，无性系对于P．ramorum种群生物学十分重要。无性系描述需要进行大量的基因标记，主要包括交配型(A1或A2)标记、同功酶基因型标记和DNA指纹标记。P．ramorum变异性较大，严重限制了种群基因型研究。利用交配型标记、无性基因标记和生物化学标记为P．ramorum种群研究提供可靠且持续的依据。Elliotetal．利用PCR-RFLP标记技术研究确定了P．ramorum种群由3种无性系组成:一种源自欧洲(EU1)，另外两种源自美国(分别为NA1和NA2)［8］。最初的交配研究表明，所有的EU1世系都是A1交配型，而NA1和NA2世系均为A2交配型［1，9］。但自2003年以来，欧洲发现了A2型菌株［10］，美国也发现了A1型菌株［11－12］，这表明了不同交配型之间杂交的潜力。无性系之间的区别不仅表现在交配型上，在形态学［13］、侵染力［9］、保守基因的核苷酸序列［14］以及遗传多样性［15－16］方面都存在差异。但是这些世系是古已有之还是近代人为原因造成的并不清楚。为了解这3种世系的进化历史以及它们之间的关系，Gossetal．分析了一段具有5个细胞核突变位点的DNA序列，发现同一世系内的菌株之间并没有区别［17］。联合多种研究方法分析表明，3种世系大约已经进化了有16.5万～50万年的历史。基因中包含了3种世系历史性重组的鲜明特征，表明P．ramorum的祖先是通过有性生殖完成繁衍的。3种世系的基因差异很大，表明它们并不是通过单一的杂交繁殖种群产生的。相反，3种世系更可能来自3种不同的地理位置，它们在进入北美洲和欧洲之前各自独立进化。

1．3病原菌培养

阴冷潮湿的环境对病原菌的生长有利，特别是当叶片及树皮表面出现水膜时更有利于菌丝的生长［18］。病原菌生长的最适温度为20℃，在15～25℃的条件下均能正常生长;－1℃时病菌生长缓慢，－9℃时仍可存活;当外界温度超过30℃时，菌丝即停止生长:但是如果病原菌在阴冷的雨季侵入寄主，30℃的非持续气温下病害仍然发生［1，10，19］。

2传播方式

P．ramorum可以产生厚垣孢子和游动孢子。游动孢子具鞭毛，可以自由游动。孢子可借助风力在空气中近距离传播，亦可借助雨水喷溅到易感植物上面，或者通过河流传播到较远的地方;远距离传播则主要是借助人类活动和寄主植物调运以及进出口贸易［20］。

3分子生物学和免疫学技术在P．ramorum研究中的应用

作为形态学鉴定的辅助，分子生物学和免疫学方法检测P．ramorum的技术亦层出不穷，主要包括基于核糖体ITS片段和线粒体基因片段的传统PCR方法，PCR-SSCP技术，PCR-RFLP标记技术，ELISA法，巢氏PCR法，以及微卫星分子标记技术等等。

多数研究表明，以美国农业部动植物检疫局推荐的巢式PCR技术和欧洲及地中海植物保护组织(EP-PO)推荐的荧光PCR技术最为成熟可靠。一般来说，ELISA法具有相对较高的通量，可以减少样品的使用量。ELISA法可以用来筛选所有的疫霉属，但仅仅能鉴定到属，而不能达到鉴定到种的水平［21］，可以作为检测的第一阶段，以便PCR技术的进一步施行。

Hayden等运用SYBRGreenI核酸染料，以ITS片段为基础，利用实时荧光PCR技术检测出了P．ramorum［22］。Hughes等对这一方法改进，发明了一种特殊的仪器(SmartCycler)，可以在野外使用［23］。

Bilodeau等以ITS、β微管蛋白和隐地蛋白等片段为基础，利用TaqMan探针和SYBRGreenI核酸染料检测出了P．ramorum［24］。但是较多研究表明，利用核糖体的ITS区域不能准确区分P．ramorum与其相近的疫霉属以及P．ramorum的3种世系［22，25－26］。由于线粒体基因Cox1在基因组里显示出高拷贝数，与单拷贝基因相比，它提供了一个较大的目标集中区，而且它在P．ramorum的3种世系间的片段是不同的［14－15，27］，所以被较多的运用到分子生物学的研究中。ElliottM等利用基于Cox1基因的PCR-RFLP分子标记技术确立北美和欧洲P．ramorum种群的3种世系，他们首先利用ApoI把P．ramorum从其他种群里分离出来，把EU1世系从北美洲种群里分离出来，然后利用AvaI区分NA1和NA2的基因型［8］。

伴随着线粒体DNA序列的测序成功，利用实时荧光PCR技术来检测P．ramorum的技术发展越来越快。与传统的PCR方法相比，实时荧光PCR技术具有更高的敏感性和更强的特异性。TooleyPW等利用线粒体基因片段结合此技术鉴别了P．ramorum和P．pseudosyringae(一种在意大利发现的新种)［18］。实时荧光PCR技术可以非常迅速地检测来自野外的少量样品，通过序列来区分菌株，因为同样大小的样品虽然在序列上有轻微的差异，但它们的解链温度并不一致［28－29］。更简单的方法例如PCR-RFLP技术和巢氏PCR技术可以在大多数实验室进行并且不需要很专业的设备。IvorsKL等利用RFLP技术表明在北美洲种群里，一个单一的无性系占据主导地位，而欧洲的种群则是由一列独特而紧密联系的RFLP类型组成的。同时，他们还分析了3条基因片段(ITS，coxII，nad5)的序列，结果表明所有的P．ramorum菌株的这3段序列都是相同的，系统发育分析表明P．ramorum与P．lateralis及P．hibernalis亲缘关系最近［16］。IvorsKL等通过研究发现在加利福尼亚州苗圃里的病原菌基因多样性比森林里的高一些［15－16］。

在P．ramorum世系中，高变量微卫星标记技术已经被证明可以调查其种群结构。微卫星作为共显性标记最突出的特点是可以呈现出较高的变异性，从而被频繁地应用于种群基因结构的研究中。但是对于无性繁殖的生物体来说，多变微卫星位点的识别仍然鲜有研究。

IvorsK等［16］和ProsperoS等［30］分别设计了12对和10对微卫星标记，但只有少数在NA1世系中展现出极强的变异性。IvorsK等在美国森林的种群里没有发现变异，而ProsperoS等于2001至2004年间分别在俄勒冈州的一片独立森林的固定样点以及俄勒冈州的苗圃里采集分析了292个病原菌种群的基因结构，结果表明，在俄勒冈州的森林和苗圃之间缺乏基因交流，而且森林里的基因多样性较低，在这4a里，森林里的多基因座基因型是非常普遍的，每年也会出现低层次的基因型。

BoutetX等利用微卫星分析发现交配后代呈现出基因重新排列的现象，这种现象要么是两种亲本(EU1×NA1)的等位基因重组，要么是在由杂合性向纯合性转移的过程中导致某一亲本的等位基因的缺失(EU1×EU1)［5］。

MascherettiS等利用minimum-spanningnet-work方法分析了这些多基因座遗传型(MGs)，发现一般的较常见的基因型分布在中间，而特殊的个体分散在各个枝端，这些特征与随着本地进化而进化的少数普通基因型的集群现象相符合。他们还利用分子变异分析和空间自相关分析研究了病原菌的起源和现今的基因结构，并利用一段非常小的样本量分析了病原菌潜在的传播方式［31］。

近年来，科学家们利用基于微卫星标记技术的分子分析方法证实，分布在北美洲和欧洲的3种世系(EU1、NA1、NA2)分别簇集在3支独立的进化枝上［15，27，32］。第1支(EU1世系)包括欧洲分布的唯一无性系以及偶尔发现于北美洲苗圃，第2支(NA1世系)主要是分布在北美洲森林和苗圃的世系，第3支(NA2世系)仅存在于加利福尼亚州以及华盛顿州的少数苗圃里。

4P．ramorum对生态环境的影响

P．ramorum对生态环境的影响不仅体现在直接致死树木上，还有许多间接影响。RizzoD等指出，许多很严重的影响并不会在短期内体现出来，而是一个长期的过程［33］。一些研究案例已经体现出短期的间接影响。WaringK等研究发现，密花石栎的致病死亡可以间接导致周围红杉林的生长速率增加［34］。也有很多研究根据现今的观测数据和重建技术证明了短期影响并推测出了未来状况，例如，RamageB等利用此方法调查了P．ramorum对红杉林特有构型的影响［35］。P．ramorum对生态环境的长远影响也可以从经历过林木死亡惨重地区的再生模式推测出来。现今的再生模式需要考虑哪些树种可以取病地区的密花石栎，过渡期对发病的森林来说很重要，尤其是那些树种多样性很低的森林类型(比如红杉林)。RamageB等综合调查了受P．ramorum影响的森林再生过程，发现在密花石栎死亡的地区，并没有其它阔叶树种可以替代密花石栎。另外，某些受害严重的地块缺乏足够的树种占据可利用的生长空间。他们在调查中发现了不适当的再生模式，最适当的再生模式并没有显现［36］。需要注意的是，此研究仅设了一个研究区域(加拿大的马林郡)，仍需后续研究的补充才能在更宽泛的尺度上得以论证。

5野外和苗圃防治

目前，虽然有各种方法可以降低P．ramorum的影响，但并没有一项可以确保消除此病原菌，甚至难以确保1株树免受其害。由于林分类型不一，同一种方法不可能适用于所有的森林类型，民众接受程度以及财政负担程度也是一些举措能否成功应用的决定性因素。但是，如果认真、彻底地采取某些措施，是可以减缓病原菌的传播速度，降低病原菌对树木危害的。

5．1野外防治

在美国的俄勒冈州，人们基于景观和地区水平开展对P．ramorum的防治管理工作，以彻底根除所在林地发现的病原菌。措施包括:飞机侦测和水道监控等一系列的前期检测;由美国农业部动植物卫生检疫局和俄勒冈州农业部共同领导检疫，以阻止本地区的染病寄主材料移出;一旦发现有树木感染，不管有没有产生症状，立即移除，并在每一个受侵染的树木周围设立91.44m的缓冲区。

5．1．1栽培技术

SwieckiT等做了一项研究，如果在一棵禾叶栎周围5m范围内栽种月桂树，即可有效预测疾病风险，降低橡树受侵害的可能。这为采用改变栽培技术的方法帮助林木抵抗P．ramorum提供了强有力证据［37］。

5．1．2化学防治

GarbelottoM等对健康的栎树和密花石栎使用亚磷酸盐杀真菌剂处理，效果良好［38］。亚磷酸盐并非直接作用于疫霉属病原菌，而是通过注射至树干或直接喷洒在树干表面促使树木产生各种各样的免疫反应，对生态环境无任何污染。

5．1．3造林方式

ValachovicY等在美国加州西北海岸的洪堡郡做了一个试验，通过改变造林方式来防治P．ramorum［39］。在受侵染的林分设置许多重复试验，通过锯割并转移密花石栎和月桂树来降低潜在的菌株密度。这是美国加州第一次基于林分水平的大规模造林试验的尝试。

5．2苗圃防治

5．2．1化学防治

针对重要的观赏植物和圣诞树进行了多种化学药剂防治试验—P．ramorum的主要4属寄主植物，即杜鹃属、山茶属、荚蒾属和马醉木属。精甲霜灵、甲霜灵、烯酰吗啉、咪唑菌酮4种最有效。多种研究表明:化学药剂一般只能起到预防作用，并不能根除病原菌，需要重复间隔使用，而且掩饰病害症状、影响检疫，长期使用病原菌会产生抵抗力［40］。

5．2．2灌溉用水

如果灌溉用水的源头是溪流，则有可能被森林里的病原菌侵染，很多研究的焦点集中在根除灌溉用水中含有的P．ramorum菌株。WerresS等设立了一个水再循环模拟系统，用2a的时间研究P．ramorum在不同季节水中的存活率与感染率［41］。容器育苗的苗圃把容器里的再循环水作为灌溉用水，研究病原菌在水中的传染病学是非常重要的，这项研究可以了解P．ramorum在水中可能的传播方式。UferT等在德国做了3种类型的过滤实验:慢砂滤池法、熔岩过滤法、人工湿地法，结果表明，前两种方法可以完全滤除P．ramorum菌株，人工湿地法仍有37%的水样含有病原菌［42］。

5．2．3土壤灭菌

尽管P．ramorum在土壤中的存活时间还没有确定，但是掌握病原菌在苗圃土壤里的分布并对侵染区隔离治理却十分必要。大量的化学药剂(三氯硝基甲烷、甲胺磷、碘甲烷和棉隆)筛选试验表明，当受侵染的土壤放入玻璃容器时，所有药品都是有效的。棉隆烟熏法14d可以根除自然环境下苗圃土壤剖面的病原菌［43］。蒸汽消毒和日晒等其它的土壤灭菌法也在研究中。对苗圃内防治P．ramorum的研究已经从个体植株扩展到苗圃环境、病原菌随植株跨州乃至跨国传播等领域。鉴于该病菌的危害和传播途径，对于地区与国家之间的观赏植物贸易往来，一定要建立一个稳定健全的检验检疫机制。

6问题与讨论

直到现在，对P．ramorum起源的地理中心仍然不清楚。有学者认为起源于美国本土［44－45］，但更多的学者倾向于源自中国云南、喜马拉雅山脉的东部或者台湾［46］。另外，因为每个国家或地区的自然条件不同，各国尚未建立一套对P．ramorum成熟、稳定的检测方法。美国和欧盟已经制定出P．ramorum的检疫标准，但随着对病原菌研究的深入，这些标准一直在调整之中，而且在许多方面有差异。

P．ramorum的寄主十分广泛，对针、阔叶树，乔、灌木，成熟林或苗木，都可侵染危害。迄今为止，在自然界被P．ramorum侵染并通过柯赫氏法则(Koch’sPostulates)证明的寄主植物有45种，有82种相关寄主植物是在自然界发病、经分离培养或PCR分子技术检测到P．ramorum，但未通过柯赫氏法则证明，还有许多植物已通过人工接种试验发病［47］。中国幅员辽阔，树种繁多，多数寄主植物都有分布。鉴于P．ramorum传入、定殖以及扩散的风险性相当大，每个国家和地区都要做好相应的检疫及防范措施，加大科研投入，以有效控制该病原菌对全世界造成的危害。