丁醇关键大肠杆菌研究

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本文作者：潘超强、高强、郑春阳、孟庆艳、段强、冯少龙单位：天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室工业酶国家工程实验室、天津强微特生物科技有限公司

由于公众对全球变暖以及世界范围内能源安全的担忧,使得由可再生资源生产生物质燃料越来越受到重视[13]。尽管微生物发酵产乙醇已经有很长的历史,而且在生物质燃料中扮演重要角色,但是由于它有低能量密度、高蒸汽压、高吸湿性这些缺点而不能作为汽油的理想替代品[4]。相比较而言,长链醇拥有高能量密度、低腐蚀性、低吸湿性、更易与汽油和柴油混合以及与现今的设备更好的相容性等特点,使其成为潜在的新型可再生能源替代品和燃料添加剂[5]。用丙酮丁醇梭菌发酵生产正丁醇已经拥有近百年的历史,最近也正受到极大的关注[6]。近年来,通过大肠杆菌代谢生产正丁醇,以及正丙醇、异丁醇、2-甲基正丁醇、3-甲基正丁醇等长链醇都被证明是可行的[5,711]。最近研究人员又成功地在细长聚球蓝细菌内通过光合CO2循环生产异丁醛和异丁醇[12]。2010年3月17日,异丁醇被美国LeMansSeries(ALMS)学会宣布其为第五能源。然而现今世界范围内异丁醇的生产仍然主要依靠石油为原料进行化学合成,但是随着石油价格的持续上涨,以及石油化工引起的环境污染问题等制约了其进一步发展,从而使由可再生资源生产异丁醇展示了良好的发展前景。过去的研究表明,自然界中尚未发现能够由葡萄糖合成异丁醇的原核生物。目前研究人员通过特定的基因工程技术对一些宿主菌进行改造获得合成异丁醇的能力。2007年美国UCLA的研究小组首次向大肠杆菌内导入酮酸脱羧酶和醇脱氢酶基因以改造其缬氨酸合成途径从而成功合成异丁醇[5],此后分别于2010年和2011年在谷氨酸棒杆菌和解纤维梭菌内利用此套系统实现了异丁醇的生物合成[4,13]。国内林丽华等[14]也利用相似的系统进行了异丁醇生物合成,产量达到3g/L。异丁醇的生物合成途径是将缬氨酸前体2-酮异戊酸通过2-酮异戊酸脱羧酶(KivD)代谢成异丁醛,然后由醇脱氢酶(AdhA)还原成异丁醇(图1)。大肠杆菌自身没有2-酮异戊酸脱羧酶和以辅酶Ⅰ为辅酶的醇脱氢酶,因此需要外源引进这两个基因并使其表达。本研究将乳酸乳球菌1.2829的kivD和adhA基因单独或串联克隆到大肠杆菌DH5α宿主中进行表达,从而合成异丁醇,并研究了KivD和AdhA酶活的最适温度和pH。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种和质粒:乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)1.2829购自中国科学院微生物研究所普通微生物菌种保藏管理中心,大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α为本实验室保藏。质粒pZY507由德国斯图加特大学GeorgA.Sprenger教授赠送,质粒载体pMD19-TSimpleVector购自宝生物(大连)公司。

1.1.2主要试剂:限制性内切酶SacⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、T4DNA连接酶购自Fermentas公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒与细菌质粒小提试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒购自RenogenBiolab科技有限公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、2-酮异戊酸、异丁醛、异丁醇与辅酶Ⅰ(NADH)购自美国Sigma公司;其它试剂为国产分析纯。

1.1.3培养基和培养条件:大肠杆菌培养和转化子筛选采用LB培养基,发酵培养基为添加终浓度0.2mol/L葡萄糖的LB培养基。转化子筛选培养基添加抗生素为氨苄青霉素(终浓度为100mg/L)和盐酸四环素(终浓度为50mg/L)。培养条件为37°C或30°C、200r/min。1.1.4引物:根据GenBank中乳酸乳球菌基因组序列设计PCR反应引物(表1,下划线部分为酶切位点),并委托北京华大基因技术有限公司合成。引物1-s、1-as用于扩增2-酮异戊酸脱羧酶基因kivD。引物2-s、2-as用于扩增醇脱氢酶基因adhA。

1.2方法

1.2.1表达载体pZY507-kivD、pZY507-adhA、pZY507-kivD-adhA的构建:这3种表达质粒的构建如图2所示。乳酸乳球菌基因组DNA的提取参照文献[15]进行。使用引物1、2分别进行目的基因kivD和adhA的PCR扩增,反应条件:95°C5min;92°C45s,63°C45s,72°C90s,共32个循环;72°C10min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。质粒提取、DN段与载体的酶切和连接分别参照相应的产品说明书进行,大肠杆菌转化参照文献[15]进行。

1.2.2KivD和AdhA酶的表达:将经过基因改造后筛选得到的大肠杆菌E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X(分别含有质粒pZY507-kivD、pZY507-adhA、pZY507-kivD-adhA)过夜活化后按1:100接入发酵培养基,37°C、200r/min培养,当OD600达到0.4时添加IPTG至终浓度1mmol/L,30°C、200r/min培养8h以诱导工程菌中KivD和AdhA酶的表达。

1.2.3KivD和AdhA酶的粗提:将方法

1.2.2得到的菌体离心(7000r/min,4°C,10min),再用预冷的0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.5)洗涤3遍,最后重悬于磷酸钠缓冲液中。用超声波破碎仪破碎菌体重悬液(功率400W,工作2s/间隔4s,共20min),离心(12000r/min,4°C,10min),取上清液即为粗酶液。

1.2.4异丁醇发酵:将基因工程菌E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X活化后按1:100接入于LB种子培养基,37°C、200r/min培养过夜后再以1:100接种于发酵培养基,当OD600达到0.4时添加IPTG至终浓度1mmol/L,30°C、200r/min发酵24h。

1.2.5异丁醛、异丁醇和残糖测定:发酵液中异丁醛与异丁醇产量采用Agilent7890气相色谱仪结合G1888顶空进样器测定。色谱条件:Poly-ethyleneGlycolHP-INNOWax色谱柱,FID(250°C)检测器;进样口压力4.7543psi;初始柱温40°C保持2min,再以15°C/min的速率升到110°C保持4.5min;氢气流量30mL/min,空气流量400mL/min,氮气流量30mL/min;顶空条件:炉温50°C,环温60°C,传输管温100°C,平衡时间5min,加压0.4min,注射1min,重复测定3次取均值。发酵液残糖使用SBA-40C型生物传感分析仪测定,重复测定3次取均值。

1.2.6KivD和AdhA酶活测定与蛋白电泳检测:KivD和AdhA酶活测定分别参照文献[16]和[17]进行,在4mL反应体系中,KivD和AdhA粗酶液的加入量分别为500L与15L,重复测定2次取均值。粗酶液中蛋白含量使用BCA蛋白定量试剂盒测定,重复测定3次取均值。粗酶液的蛋白电泳检测参照文献[15]进行。

2结果与分析

2.1表达质粒的构建与鉴定以乳酸乳球菌(L.lactis)1.2829的总DNA为模板,按照方法1.2.1用引物1、2分别进行PCR扩增。1%的琼脂糖凝胶电泳检测发现,在1.4kb和1.1kb附近分别有特异的单一DNA条带(图3),与目的基因片段大小一致。将PCR产物与pMD19-TSimpleVector连接后委托北京华大基因技术有限公司进行测序,经过比对,PCR产物与目的基因序列kivD和adhA基本一致。按图2所示,将质粒载体pZY507与相应的DN段进行酶切、连接并转化入大肠杆菌DH5α宿主,然后在选择培养基上挑取单菌落、提取质粒进行酶切验证和PCR验证,最后经过DNA测序验证,逐步构建得到改造菌株E.coli-K(含有表达质粒pZY507-kivD)、图3L.lactis1.2829目的基因PCR产物Fig.3PCRproductsofthetargetgenesofL.lactis1.2829注:1:1kbDNA分子量标准;2:引物1-s与1-as的PCR产物;3:引物2-s与2-as的PCR产物.Note:1:1kbDNAladder;2:PCRproductbyprimers1-sand1-as;3:PCRproductbyprimers2-sand2-as.E.coli-A(含有表达质粒pZY507-adhA)和E.coli-X(含有表达质粒pZY507-kivD-adhA),其中表达质粒pZY507-kivD、pZY507-adhA为tac启动子下的单顺反子系统,pZY507-kivD-adhA为tac启动子下的双顺反子系统,且导入的2个外源基因均携带自身的核糖体结合位点。

2.2温度和pH对KivD与AdhA酶活的影响按照方法1.2.3分别制备E.coli-K、E.coli-A、E.coli-X的KivD或/与AdhA粗酶液。按照方法1.2.6进行KivD和AdhA的酶活性质研究,温度和pH对KivD和AdhA酶活的影响结果见图411。

2.2.1温度对KivD酶活的影响:温度对酶活的影响分为两部分:随着温度的升高,(1)瞬时酶反应速率提高,对酶活为正影响;(2)酶失活速率升高,对酶活为负影响。因此,温度对酶活的影响取决于二者的强弱。由图4和图5发现,随着温度的上升,瞬时反应速率的提高对酶活的正影响逐渐被高温引起酶失活的负影响所掩盖,而且随着体系温度升高,酶反应完成程度也逐渐下降,因此较低的温度有利于酶较长时间的反应。由图可知,25°C、30°C、35°C的反应体系最终酶反应完成程度相差不大,但是鉴于25°C反应体系中初始酶活较低以及当环境温度太高时(≥35°C)细胞老化较快,不利于长时间发酵,因此之后的酶反应实验以及发酵实验均采用30°C。

2.2.2pH对KivD酶活的影响:根据图6和图7,pH变化对KivD酶活有较大影响,pH6.5为KivD酶的最适pH,而且酸性pH对KivD酶活的影响比碱性pH更为显著。

2.2.3温度对AdhA酶活的影响:图8和图9结果显示,随着温度的上升,瞬时反应速率的提高对酶活的正影响逐渐被高温引起酶失活的负影响所掩盖,而且随着体系温度升高,酶反应完成程度也逐渐下降,因此较低的温度有利于酶较长时间的反应。由于25°C和30°C的酶反应速率差不大以及体系反应程度的微小差异,考虑到较高的温度有利于菌体的生长代谢,因此之后实验的酶反应温度以及发酵实验均采用30°C。

2.2.4pH对AdhA酶活的影响:图10和图11结果表明,pH对AdhA酶活有较大影响,pH6.5为AdhA酶的最适pH,而且碱性pH对AdhA酶活的影响比酸性pH更为显著。

2.3粗酶液中蛋白含量测定与蛋白电泳结果按照方法1.2.6测定了粗酶液中蛋白含量,结果见表2,粗酶液蛋白电泳结果见图12。由图12发现KivD在E.coli-K中成功表达,AdhA在E.coli-A中成功表达,KivD和AdhA在E.coli-X中成功表达,但是由酶蛋白条带的亮度可以看出KivD的表达量明显低于AdhA。

2.4发酵产物及残糖测定结果按方法1.2.5测定发酵液中异丁醛与异丁醇的产量和残糖量,结果见表3。由表3发现只有串联克隆表达kivD和adhA基因的菌株E.coli-X才能够合成异丁醇。菌株E.coli-K由于缺少将异丁醛还原成异丁醇的醇脱氢酶,其发酵液中只有痕量的异丁醛但没有异丁醇。异丁醛产量低有可能是因为由于异丁醛的积累对KivD乃至宿主自身造成了抑制,使得异丁醛不再继续积累。

3讨论

虽然目前尚未发现能够天然发酵产异丁醇的微生物,但通过合成生物学手段改造的代谢工程菌株已经可以在实验室规模初步实现这一目的。如UCLA的研究小组在大肠杆菌中过量表达了缬氨酸合成路线上游的3个基因(alsS、ilvC、ilvD),并敲除了相关代谢旁路的关键基因(adhE、ldhA、frdAB、fnr和pta)后,通过112h的长时间补料发酵,异丁醇最终产量可达到22g/L[5],证明了利用基因工程菌发酵生产异丁醇具有潜在的工业化前景。本研究构建的基因工程菌株E.coli-K(含有表达质粒pZY507-kivD)、E.coli-A(含有表达质粒pZY507-adhA)和E.coli-X(含有表达质粒pZY507-kivD-adhA)分别表达了KivD、AdhA和KivD与AdhA酶活力,表明质粒pZY507中tac启动子下的单、双顺反子系统可单独或共同表达kivD与adhA基因。与表达的酶活相对应,E.coli-K只产微量的中间体异丁醛,E.coli-A不产异丁醛与异丁醇,只有E.coli-X发酵24h异丁醇产量为0.12g/L。虽然E.coli-X的异丁醇产量与国内外的研究结果有较大差距,但本实验进一步证明了这条合成路线具有可实行性,并为下一阶段的研究奠定了基础。酶活测定中粗酶液添加量的不同和SDS-PAGE结果证实,异丁醇产量不高的原因是KivD的酶量表达远低于AdhA,此现象是否由基因串联表达所引起有待于进一步研究,但该实验结果揭示了KivD的表达量成为合成异丁醇的瓶颈。今后如能采用源自高酶活菌株的kivD基因重新构建表达质粒,或大幅度提高现有kivD基因的表达,并结合性能优良的大肠杆菌宿主与优化培养条件等措施,则异丁醇产量应有较大提高。