空气环境对益生菌影响

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本文作者：其木格苏都、白梅、孔亚楠、魏爱彬、王记成、张和平单位：青岛君益食品有限公司、内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

乳酸菌是发酵食品中的自然生物防腐剂,而其中的一些菌株对宿主健康有益,被称为益生菌。发展到现在,由2001年FAO和WHO提出的益生菌定义为大多数学者所认可,即“当给予宿主足够的量时,可以对宿主起到有益作用的微生物活体”。益生菌制品从最初的亚洲小作坊加工逐渐传播到欧洲和美国市场,由此而生的功能性食品更是目前增长最快的食品之一[1]。全球工业分析家预测预计到2015年全球益生菌市场将达到288亿,即使这样依然认为该市场还处于起步阶段,有着巨大的发展空间。因此,需要更有效、稳定的益生菌及益生菌产品来迎接应对这一挑战。饮食是摄入益生菌最方便的方式,特别是便于储存、装卸、运输,而且是在保质期内稳定的功能性益生菌食品。乳及其制品是大多数益生菌良好的载体,其中发酵乳是公认最好的载体之一。肠道中足够的益生菌活菌数是对宿主达到良好益生功效的保证[2],因此各个国家对产品中益生菌的活菌数都有明确规定,其含量不得低于106CFU/mL[3]。双歧杆菌(Bifidobacterium)的益生特性已被人们普遍接受,但Bifidobacterium属于专性厌氧菌,在工业化生产时需要解决由于氧中毒而导致其活菌数较低的问题。Miller、CraigWilliam等[45]将高氧气消耗菌种与双歧杆菌进行复配,兼性厌氧菌嗜热链球菌(Stretococcusther-mophilus)在生长时能利用溶解氧,可有效保护双歧杆菌生长,但到发酵后期,S.thermophilus代谢产生的酸会抑制Bifidobacterium生长,所以这种保护只在发酵初期有效,对随后的加工及贮存期间溶氧起不到作用(酸奶一般用聚乙烯和高聚苯乙烯来包装,厚度在300μm350μm之间,对酸奶的溶氧率为1.05.0cm2/(kg•d)[6])。Dave和Shah报道将L-半胱氨酸[7]和抗坏血酸[8]作为除氧剂添加到酸奶生产中,L-半胱氨酸是一种含硫氨基酸,既可以降低氧化还原电位,又可以作为一种氨基酸氮源;抗坏血酸是一种常见的食品添加剂,二者都可以减少溶氧维持低的氧化还原电位,有利于Bifidobacterium生长,但会影响到一般酸奶发酵剂中S.thermophilus的生长,进而影响到酸奶的质构和风味,因此对于一般酸奶可能不太适合。微胶囊包埋技术也被用来提高Bifidobacterium活菌数,但多项研究表明微胶囊包埋只对一部分菌有作用,应用受限[9]。Mills等研究发现,直接降低溶氧、氧化还原电位可保护非发酵巴氏杀菌乳在储存期间的Bifidobacterium活菌数[10],但只能维持原来的接菌量,活菌数不会增加。乳双歧杆菌V9(B.lactisV9)分离自健康蒙古族儿童粪便,其具有较强的耐酸性,在人工胃肠液中具有良好的耐受性[11]。对致病菌株(志贺氏痢疾杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、埃希氏大肠杆菌)具有一定程度的拮抗作用,可以有效治疗小鼠的腹泻[12]。临床研究表明,B.lactisV9具有调节肠道菌群的作用,对便秘和急慢性腹泻患者治疗效果显著,服用B.lactisV93周,对便秘、急性腹泻和慢性腹泻患者的治疗有效率分别为95.3%、95.4%和89.9%[13]。对其基因组学研究显示,其菌株遗传极为稳定,在传代保藏过程中发生重组、突变几率极小,可保障其安全生产[14]。本文以上述综述为出发点,通过改变培养基质中气体组成,研究B.lactisV9在固体MRS培养基表面和液体MRS及脱脂乳中的生长情况,为其在益生菌制品生产应用开阔思路,并提供理论依据和数据参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源:B.lactisV9由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种保藏中心(LABCC)提供。

1.1.2试剂和仪器:纽西兰超特级脱脂乳粉;合成MRS培养基(Oxoid);高纯气体(北京华通精科气体化工有限公司);REX-C700厌氧培养箱;厌氧指示条(Oxoid,AnaerobicIndicatorBR0055);除氧剂(Oxiod,AnaeroGenAN35);MINIVACPD-52真空泵(Yamato-ULVAC,日本);U-2000型紫外可见分光光度计(HITACHI,日本);1100液相色谱系统(Agilent,美国);NSC-ⅡA-1200无菌工作台;HA-300M全自动高压灭菌器(HIRAYAMA,日本)。稀释液PBS和双歧杆菌选择性培养基TPY的配制参照文献[11]。

1.2方法

1.2.1菌落形成:将真空冷冻保存的B.lactisV9菌粉接种于液体MRS培养基中,37°C厌氧培养活化2代后,划线于固体MRS培养基上,并将划线平板分别置于普通培养箱(空气环境,N2:O2≈79:21)、充氮气培养箱(N2:99.99%)和混合气体培养箱(N2:H2:CO2=80:10:10)中,37°C恒温培养72h,观察菌落形成状况。在厌氧培养箱中预置厌氧指示条以检验无氧环境。用于划线的固体MRS培养基预先置于厌氧培养箱24h进行脱氧处理。在厌氧培养时,培养箱中空气要先充高纯氮气置换2次,然后再充混合气体或氮气。保证每次充气后培养箱为正压,防止空气吸入,同时可以在培养期间随时观测培养箱的密封情况。另外,培养箱中预先放置除氧剂和厌氧指示条,充气后指示条的颜色由浅红色转变为白色,说明培养箱中为无氧环境。

1.2.2B.lactisV9在MRS液体中生长:B.lactisV9活化方法同1.2.1,跟踪测定第3代OD600值,取OD600=1.0(Mid-logphase)时培养液以2%(V/V)接种于MRS液体中,分别置于普通培养箱和混合气体培养箱中,37°C恒温培养。具体操作方法同1.2.1。每3h测定pH值、OD600值和活菌数,同时留样测定乳酸和乙酸含量。

1.2.3B.lactisV9在脱脂乳中生长:B.lactisV9活化方法同1.2.1,取第3代OD600=1.0时菌液离心所得菌体,加同体积11%灭菌脱脂乳,以2%接种于巴氏杀菌(95°C,5min)脱脂乳中,分别置于普通培养箱和混合气体培养箱,37°C恒温箱中培养。具体操作方法同1.2.1。每6h测定pH值、OD600值和活菌数,同时留样测定乳酸和乙酸含量。

1.2.4pH值测定:试验样品调整温度至20°C,采用精密pH计(雷磁PHS-3C,海精密科学仪器有限公司)测量。1.2.5浊度测定:MRS培养基样品适当稀释后测定,以未加菌的空白样为参比,采用比浊法于600nm处测定其浊度。

1.2.6活菌数测定:10.0g样品于90.0gPBS稀释液中,于水平摇床(200r/min)振摇15min,然后梯度稀释,采用双歧杆菌选择性培养基TPY固体培养基平板倾注法,37°C厌氧(N2:H2:CO2=80:10:10)培养72h。

1.2.7液相色谱法测定乳酸、乙酸含量:准确称取样品1g于10mL离心管中,加入3mL1mol/LHCl振荡混匀,3500×g,离心10min,95°C水浴15min。取上清液经0.45μm膜过滤待进样分析。色谱条件:流动相:甲醇缓冲溶液(浓度为10mmol/L的PBS,pH2.0)=3:97(V/V),流速为0.5mL/min,紫外检测波长为210nm,柱温为35°C,进样量10μL。1.2.8数据统计分析:试验数据采用SASANOVA程序处理。

2结果与讨论

2.1气体环境对B.lactisV9菌落形成的影响双歧杆菌是一类专性厌氧乳酸菌,既没有呼吸链也不含有过氧化氢酶,一般认为是严格厌氧的,因此在工业化生产中会出现氧中毒。然而在具体的培养中发现,部分菌株具有氧代谢酶,可以在0.1%21.0%氧气环境中存活[1519],表明不同的双歧杆菌菌株对氧气的耐受能力不同。目前,国内在双歧杆菌菌种的分离鉴定中较常使用的厌氧气体组成为N2:H2:CO2=80:10:10[11],同时,越来越多的研究发现,一些双歧杆菌的氧气耐受力与二氧化碳有关,即这些菌只在二氧化碳存在时才表现出一定的氧耐受力。对于B.lactisV9,在空气、氮气和混合气体环境中,其菌落形成情况完全不同,见图1。在混合气体和氮气环境中菌落形成明显多于空气环境,说明B.lactisV9在很大程度上受到了空气中氧气的抑制。B.lactisV9在混合气体中菌落生长状况优于氮气中的,说明单纯的无氧环境不一定能保证B.lactisV9的生长处于最佳状态,还需要考虑无氧气体环境的组成成分。此结果与ShinjiKawasaki等[20]的报道一致,在无氧条件下,CO2可以促进双歧杆菌菌落生长,但不会改变菌株的氧气耐受能力。部分双歧杆菌菌种在CO2存在时具有一定的氧耐受性,而且可在一定浓度的CO2条件下生长,也是部分双歧杆菌的分离鉴定依据。CO2刺激菌落形成与一些参与CO2固定、水解和羧基化反应的酶有关。另外,推测可能因为CO2是氧化形式的“C”,可以像氧气一样作为电子受体,来维持细胞内氧化还原电位平衡。但CO2促进作用的具体机理还有待研究。本实验结果表明,B.lactisV9不是严格厌氧菌,在空气环境中有菌落形成,但在混合气体环境中生长更加良好。

2.2气体环境对B.lactisV9在液体MRS培养基中生长的影响鉴于2.1的研究结果,采用混合气体和空气条件对B.lactisV9的生长进行进一步研究。混合气体和空气环境下,B.lactisV9在液体MRS培养基中的生长曲线见图2。可以看出,在混合气体环境中,B.lactisV9生长曲线呈“S”型,18h左右是对数生长中期(Mid-logPhase),24h开始进入稳定期;而在空气环境中,OD600值一直持续缓慢增长,表示B.lactisV9生长明显受到限制。另外,在混合气体环境下,由于CO2在液体MRS中的溶解,不接种B.lactisV9的液体MRS作为对照样培养30h后的pH值从初始6.43降到了6.29。从表1可以看出,接种B.lactisV9培养30h后,混合气体环境pH值(4.42±0.24)显著低于空气环境pH值(5.55±0.24)(P<0.01)。从B.lactisV9的生长趋势和培养基的pH值变化上可以看出,液体MRS培养基在混合气体环境下可有效促进B.lactisV9生长。这一点也可以从活菌数变化上得到证实,培养24h后,混合气体环境中B.lactisV9活菌数(9.11±0.11logCFU/mL)显著高于空气环境(8.04±0.10logCFU/mL)(P<0.01)。现有的研究表明,对氧气敏感的双歧杆菌在有氧时会积累H2O2,而H2O2会抑制其糖代谢的关键酶——果糖-6-磷酸-磷酸酮酶(F6ppk),从而引起氧中毒[17]。在这些反应中,NADH氧化酶、NADH过氧化酶和超氧化物歧化酶(SOD)的作用最关键。在一定范围内增加氧气的浓度,双歧杆菌分解H2O2的NADH氧化酶和NADH过氧化酶活力都明显高于无氧环境[21]。这些酶在兼性厌氧乳酸菌中也存在,并且某些菌株在有氧环境下生长良好,这种对氧气的耐受能力与菌体内碳水化合物代谢转变联系在一起。本研究对培养基中主要的碳水化合物——葡萄糖的代谢产物乳酸、乙酸的含量进行了跟踪检测。本实验所用液体MRS培养基中含有16.70±0.35mmol/L的乙酸(源于添加的无水乙酸钠),不含有乳酸。培养24h时,去除原来培养基中含有的乙酸,在混合气体环境下B.lactisV9代谢生成的乙酸和乳酸量分别为12.79±0.86mmol/L和11.99±0.73mmol/L,显著高于在空气环境中生成量为0.65±0.07mmol/L和2.75±0.57mmol/L(P<0.01),混合气体和空气环境中乙酸/乳酸比值分别为1.06:1和0.24:1。Talwalkar和Kailasapathy研究了4株双歧杆菌在不同氧环境中的代谢变化,发现每个双歧杆菌菌株的氧耐受能力不同,如代谢物中乙酸与乳酸的比例随着环境中氧气浓度的增加而减少[21]。R.González报道[22],在缺氧条件下,代谢TPYG培养基产乳酸的最大浓度为8.1mmol/L,乙酸/乳酸的摩尔比为3.5:1;而在有氧条件下,乳酸浓度增加超过2倍,乙酸/乳酸下降到1.5:1。本研究发现,液体MRS培养基中乙酸、乳酸产量受气体组分条件影响,在混合气体环境下产生的乳酸浓度是空气环境的4倍左右,而乙酸却多出约20倍。当有氧培养转向无氧培养时糖代谢产物会发生变化,主要是乳酸转化成乙酸,同时伴随产生2倍的ATP[23]。以上结果可以说明混合气体环境有利于B.lactisV9在液体MRS培养基中生长,可以有效增加活菌数,代谢产生乙酸、乳酸量增加,且改变了乙酸与乳酸比例。

2.3气体环境对B.lactisV9在脱脂乳中生长的影响在巴氏杀菌脱脂乳中,B.lactisV9的生长情况与液体MRS培养基中类似,pH值和活菌数变化结果见表2。发酵18h,混合气体环境pH值(4.48±0.07)显著低于空气环境pH值(5.03±0.12)(P<0.01),混合气体环境的活菌数(9.02±0.15logCFU/mL)显著高于空气环境的活菌数(8.53±0.08logCFU/mL)(P<0.01)。混合气体和空气环境下发酵脱脂乳产生的乙酸、乳酸量分别为60.52±2.30mmol/L、5.17±1.02mmol/L和16.86±0.34mmol/L、5.92±0.81mmol/L,乙酸/乳酸比值分别为11.71:1和2.85:1。在混合气体环境下,B.lactisV9发酵脱脂乳(主要是乳糖)生成的乙酸量远远多于乳酸。此结果与B.lactisV9在MRS中生长类似,B.lactisV9发酵脱脂乳生成的酸以乙酸为主。Meile等[24]发现乳双歧杆菌可以耐受反应器顶空10%氧气,在氧气环境中乳酸浓度为9.9mmol/L,明显高于厌氧条件下的5.6mmol/L,乳酸的增量引起了代谢产物中乙酸/乳酸摩尔比的变化,从10.1:1降到4.7:1。这样的变化趋势与本实验结果类似。但是乙酸/乳酸摩尔比的变化范围相差较大,这可能是由于菌株自身特性、介质中糖浓度不同以及气体条件不同等因素造成的。从本研究对益生菌B.lactisV9的研究可以看出,无氧环境的气体组成会影响到B.lactisV9的生长及代谢。目前,我国国标《GB4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[25]和《GB/T4789.34-2008食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》[26]中在对双歧杆菌计数方法中只提到“厌氧培养48±2h后计数平板上的所有菌落数”,未对具体的气体环境做出规定。所以对于B.lactisV9而言,同为厌氧条件的纯氮气环境和混合气体环境,B.lactisV9的菌落形成明显有差异,这样就有可能在执行标准时因为厌氧气体组成的不同造成B.lactisV9活菌计数结果的不同。诚然,双歧杆菌活菌计数结果还受其他诸多条件影响,正如刘伟等所报道的“双歧杆菌目前还没有一套准确和严格的计数方法”[27],这就需要人们进一步全面地探索研究。

3结论

本研究通过在固体MRS培养基、液体MRS培养基及巴氏杀菌脱脂乳接种乳双歧杆菌BifidobacteriumlactisV9(B.lactisV9),研究不同气体环境对B.lactisV9生长及代谢的影响。研究显示,B.lactisV9不是绝对厌氧菌,混合气体(N2:H2:CO2=80:10:10)环境可有效促进其菌落形成,更有利于其在MRS液体和巴氏杀菌脱脂乳中生长。此混合气体环境,可应用于益生菌制剂及制品的生产。这一研究结果可为B.lactisV9益生菌发酵乳的生产和产品中B.lactisV9活菌培养计数提供指导。此外,气体组成条件对代谢产物中乙酸/乳酸摩尔浓度比变化的影响,为改善益生菌产品口感提供新思路和可行性证据。综上研究可见,环境中气体组成影响着B.lactisV9的生长速度及代谢组成,但具体的相关关系和作用机理尚不明确,仍需深入研究。