抗菌蛋白单胞菌抑杀作用

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本文作者：苑园园、刘清明、廖富蘋、林健荣单位：华南农业大学动物科学学院

嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是水产养殖重要的条件致病菌,能够引起多种水产动物败血症,危害极大。目前由该菌感染引起的疾病绝大多数依赖抗生素药物治疗,对水环境、水产品质量和人类健康等的安全造成重要影响[1]。因而,采用生物防治技术或利用生物产物进行水产养殖动物嗜水气单孢菌感染症的预防和治疗有重要意义。近年来,我国在嗜水气单胞菌的生物防治领域已取得一些进展,单晓枫等[2]研究了粪肠球菌MLS-7对嗜水气单胞菌有较强的抑菌作用,宋铁英等[3]从土壤和植物中分离纯化出拮抗菌LB3、K1、K29、E43,对防治鳖的嗜水气单胞菌感染症有效,秦生巨等[4]发现8株蛙弧菌对河蚌嗜水气单胞菌具有裂解效果。周飞等[5]发现金银花对嗜水气单胞菌有较强的抑菌作用,彭金菊等[6]在32味中药中筛选出五倍子、栀子、诃子、五味子、乌梅、黄芩、川黄连、石榴皮等8味药物对嗜水气单胞菌具有较强的抑菌活性,张梁[7]的研究表明大蒜素对引起草鱼肠炎的豚鼠气单胞菌具有显著的体外抑菌及防治效果。芽孢杆菌是一类重要的具有生防潜力的细菌,这类菌株能产生多种抗菌物质[8],多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspo-lymyxa)CP7菌株是本课题组分离获得的一株具有广谱抗病原菌活性的拮抗性细菌,能够分泌多种抗菌活性物质[9],在其发酵培养的上清液中,已知有3种抗菌物质存在:第1种是由23个氨基酸组成的具有抗革兰氏阳性菌的Cpacin抗菌肽(廖富蘋等,发明专利号:200710118975)[10];第2种是抗革兰氏阴性菌的多粘菌素类物质[11];第3种是抗真菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶[12]。本文研究了CP7菌株的抗菌蛋白(CP7ACP)对嗜水气单胞菌S12菌株的抑杀作用机理,为CP7ACP在水产致病菌嗜水气单胞菌的生物防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1菌株多粘类芽孢杆菌CP7菌株为本实验室保存,嗜水气单胞菌S12菌株来自中国水产科学研究院珠江水产研究所。

1.2CP7ACP的制备挑取平板培养的CP7菌株单菌落接种于5mLYEPD液体培养基中,于30°C、180r/min恒温摇床中培养24h作为种子菌液,按1％接种量(体积比)转接到发酵培养基中,于30°C、180r/min恒温摇床中培养48h。将培养液置于沸水浴中处理20min后,迅速取出冰浴冷却,于4°C、10000r/min离心20min,收集的上清液经0.22μm滤膜过滤后用33%硫酸铵饱和度沉淀其蛋白,经透析,即为菌株抗菌蛋白提取液,于20°C冰箱保存备用。可溶性蛋白的含量测定采用考马斯亮蓝显色法测定抑菌蛋白的浓度。

1.3抑菌试验和杀菌试验S12菌液浓度经血球计数板计数为105106CFU/mL。用CP7ACP原液(浓度为27.84g/L)对S12的抗菌活性参照琼脂板孔穴扩散法[13],孔穴直径2.7mm,每孔穴加粗提液5μL,以消毒营养肉汤培养基为对照,30°C倒置培养过夜,测量CP7ACP对S12抑菌圈的直径。采用二倍稀释法测定CP7ACP对S12的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)[14]。

1.4S12磷泄漏的检测参照Newton等[15]的方法并做改进,将处于对数生长期的S12菌液于4500r/min离心10min,收集菌体。用pH7.0、5mmol/L的HEPES-Na缓冲液(含1%NaCl)重新悬浮洗涤除去杂质,重复23次,调节浓度约1.0×108CFU/mL;然后依次向10mL离心管中加入HEPES-Na缓冲液、S12菌液和CP7ACP的2、4倍稀释液。使菌液最终浓度为2.0×107CFU/mL。以灭菌水处理作为对照组,30°C分别孵育0、10、20、30、60、90、120、150、180min后,迅即放置在冰浴上,4°C、4500r/min离心5min,收集上清,用紫外分光光度计在OD700测定上清液中磷的吸光度,通过标准曲线的回归方程计算出含量,从而测算CP7ACP作用菌体后引起菌体磷泄漏的变化情况。处理样品中磷含量的测定采用钼锑抗(即钼酸铵-酒石酸锑钾-抗坏血酸)比色法[16]。

1.5CP7ACP对S12胞内的生物大分子物质影响的检测生物体内的紫外吸收物质主要有蛋白质、DNA和RNA等,可通过检测紫外吸收量来衡量分析,参照邹文政等的方法[17]。取对数生长期的S12,用0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液稀释为1×106CFU/mL。CP7ACP的2倍、4倍稀释液的分别与稀释菌液于30°C共同孵育10、20、30、60、90、120、150、180min,以未加CP7ACP的稀释菌液为对照;用0.22μm滤膜过滤检测液,滤液于紫外分光光度计260nm波长测定其吸光值,以其衡量CP7ACP引起S12内泄出生物大分子物质的效应。

1.6紫外光谱法分析S12基因组DNA增色效应利用TIANampBacteriaDNAKit细菌基因组DNA提取试剂盒,提取S12基因组DNA,在0.01mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.2)介质中,S12基因组DNA与CP7ACP2倍稀释液混合于30°C避光孵育,孵育时间经过3、6、12、18h后;以水调零做基线,置于紫外-可见分光光度计中进行扫描,分别测其波长在220300nm范围内的紫外吸光光谱[18]。在整个操作过程中,样品实行避光保存。

1.7CP7ACP对S12作用的电镜观察CP7ACP对S12菌体作用处理过程是:S12在营养肉汤培养基30°C条件下摇床培养12h,在对数生长期取菌液经5000r/min离心10min,弃上清收集沉淀,用10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)调节菌的浓度为1×108CFU/mL,吸取制备好的S12菌液2mL至离心管中,然后加入CP7ACP至终浓度为2倍稀释液,混匀,于30°C保温0.5、1、3h后,5000r/min离心5min,收集菌体。加入适量的PBS缓冲液洗涤菌体3次,收集菌体。以灭菌水处理的菌液为对照。分别取上述经处理的样品,加入1mL4%戊二醛固定液,混匀菌体,于4°C固定过夜。然后按常规方法处理样品后,扫描电镜观察记录、拍照。分别是取上述经处理的样品,加入适量的PBS缓冲液洗涤菌体3次,弃缓冲液(不打散细胞),加入2.5%戊二醛固定液10min,然后5000r/min离心10min,于4°C冰箱中固定过夜。然后按常规方法处理样品,透射电镜观察记录、拍照。

2结果与分析

2.1CP7ACP对S12的抑杀作用CP7ACP对S12进行抑菌试验,结果见图1,经检测抑菌圈直径约8.1mm。经测定,CP7ACP对S12的最小抑制浓度(MIC)为3.48g/L,即只需CP7ACP原液浓度的1/8便可完全抑制S12菌体的生长,最小杀菌浓度(MBC)为6.96g/L,即只需CP7ACP原液浓度的1/4便可全部杀死菌体。结果表明CP7ACP对S12有明显的抑杀作用。

2.2CP7ACP对S12磷泄漏的影响CP7ACP对S12作用后,菌体内磷的泄漏情况如图2所示。从图2中看出CP7ACP的2、4倍稀释液处理30min,S12胞外的磷就分别达到110.9和89.7μmol/L,60min后磷浓度达到最高值,分别是117.5和94.3μmol/L,经方差分析显示,P>0.05,即2、4倍稀释液分别处理30、60min时磷泄漏没有显著性差异,而与对照组相比差异显著(P<0.05)。结果表明CP7ACP能使S12胞内在短时内发生明显的泄露,并且CP7ACP浓度越高泄漏量越多。

2.3CP7ACP对S12胞内的生物大分子物质影响生物体内的紫外吸收物质主要有蛋白质、DNA和RNA等大分子物质,以CP7ACP的2、4倍稀释液处理S12,在260nm处检测培养液吸光值,分析CP7ACP影响菌体大分子物质泄漏情况,结果见图3。可见紫外吸收物质发生明显的变化,在处理030min时,紫外吸收物质量急剧上升,3060min时达到峰值,此后处于平缓的状态。对照区几乎检测不出紫外吸收物质的量值。经方差分析显示,CP7ACP的2、4倍稀释液作用后的吸光值差异显著(P＜0.05),2、4倍稀释液作用后的吸光值与对照相比差异极显著(P＜0.01)。由此推测,CP7ACP会引起S12胞内紫外吸收物质即生物大分子的外泄。

2.4CP7ACP对S12基因组DNA的作用增色效应通常是由于DNA变性引起的光吸收增加,可作为衡量DNA变性的依据。CP7ACP处理S12基因组DNA后的增色效应检测情况如图4所示。从图4中可以看出,CP7ACP处理S12基因组DNA后,在紫外光波长为260nm处发生了增色效应,处理时间越长增色效益越明显,即18h＞12h＞6h＞3h,细菌基因组DNA的紫外吸光值随作用时间的延长而上升。增色效应的发生,可能是CP7ACP与DNA表面的磷酸基团作用;或者部分结构嵌入到DNA分子沟槽中,使DNA原本收缩的构象趋于松散变性。

2.5CP7ACP对S12抑杀作用的电镜观察

2.5.1CP7ACP对S12作用的扫描电镜观察:S1被CP7ACP的2倍稀释液处理0.5、1、3h。在扫描电镜下观察其菌体的变化,如图5所示。正常S12的形态特征(图5A),菌体呈杆状,两端钝圆,结构完整,外观饱满,表面光滑、圆润无孔洞。CP7ACP处理S12,0.5h后细胞表面变得粗糙,有孔洞出现,并且有些细胞间出现粘连(如图5B箭头所示);1h后有些菌体表面有明显孔洞出现,表面凸凹不平,细胞与细胞之间的界限略变模糊,细胞形态趋向变形,边缘模糊部分粘连在一起(如图5C箭头所示);3h后菌体细胞壁呈溶解状,细胞变形破裂严重,内容物泄漏而使菌体细胞干瘪、皱缩,表面粗糙程度加重(如图5D箭头所示),另胞外可看到许多大而明显的附着在菌体上的白色分泌物,推测是正在外泄的细胞内容物(如图5E箭头所示)。

2.5.2CP7ACP对S12作用的透射电镜观察:S12被CP7ACP的2倍稀释液处理0.5、1、3h后,用透射电镜观察其细胞的超微结构变化,见图6。对照组菌体细胞的内膜和外膜结构完整,轮廓层次清晰、致密,胞内内容物充实且分布均匀,细胞边缘光滑,圆润(如图6A所示)。CP7ACP处理S12,30min后细胞内容物出现溶解,质壁分离,细胞膜开始有破损,细胞边缘及结构层次性模糊,细胞变成不规则多边形,细胞外围可见许多短线状的絮状物(如图6B箭头所示);1h后细胞壁破坏严重,出现许多缺损,细胞内结构模糊不清,原有的微细结构紊乱甚至消失,胞内内容物大量溢出,形成大片空白区(图6C箭头所示);3h后细胞壁、细胞膜破损更严重,细胞变形,出现很多缺口,胞内内容物大量流失,胞内空虚,整个细胞处于崩溃状态(图6D箭头所示)。

3讨论

目前认为抗菌肽杀菌的作用机制主要是其作用于病原菌的细胞壁、细胞膜,进而形成有规则结构的离子通道,胞浆完整性遭到破坏,细胞内外离子不平衡,使得离子或胞内内容物外泄,最终引起细菌死亡[1921]。Harder等[22]认为人抗菌肽β-defensin3能够使细胞壁形成孔洞,导致细菌死亡。徐进署等[23]证明细胞膜结构是家蚕抗菌肽CM4攻击的首要靶点。而Melittin和Pandinin是通过-螺旋的疏水中心垂直插入到细胞膜内,破坏细胞膜的正常结构[2425]。本研究通过扫描电镜观察发现,受处理的菌体细胞表面变得粗糙,细胞间出现粘连,随着作用时间的延长,细胞形态变形,细胞表面出现明显缺损,内容物外泄而塌陷,菌体破裂,菌体干瘪,皱缩而坏死。透射电镜观察细胞结构也明显看到,S12的细胞壁受损,出现孔洞;细胞膜甚至溶解,细胞器被破坏。Robert等[26]和Reddy等[27]认为抗菌物质作用于菌体后引起细胞内无机磷、DNA和蛋白质等生物大分子泄漏的原因是抗菌物质破坏了细胞壁,继而破坏细胞膜,细胞内大分子结构受到破坏,生化级联反应被阻断,从而导致胞内离子的外泄,DNA和RNA等核酸物质的泄漏,以及胞内ATP水解等,使得受处理菌菌液中的磷、DNA和核酸类物质含量增多。本研究也发现受CP7ACP处理的S12菌体内无机磷和胞内生物大分子物质大量外泄,且是在短时间内发生、呈现急剧性的。此外,Boman等[28]和Chatterji等[29]认为抗菌肽通过与细菌DNA结合进而阻断DNA的合成也是抗菌肽杀菌的原因之一。本研究发现CP7ACP使S12基因组DNA产生增色效应。这可能是CP7ACP与DNA表面的磷酸基团作用,或者CP7ACP部分结构嵌入到DNA分子沟槽中,使DNA构象趋于松散变性。综上所述,CP7ACP的杀菌机制可能破坏S12的细胞壁和细胞膜,使S12胞内无机磷和DNA等生物大分子外泄或者是抗菌物质进入胞内与基因组DNA发生结合,引起细胞结构功能的破坏而导致细菌死亡的。嗜水气单胞菌是在水体等环境中广泛分布的有害性细菌,能够引起淡水鱼类败血症,对水产养殖危害极大。目前对该病的防治,主要使用化学药物。然而,因长期、大量使用抗生素等化学药品,现已引起了许多病原菌产生了耐药性,并产生残留,影响了水产品的质量与食用安全。为此,采用生物防治技术或利用生物产物进行水产养殖动物嗜水气单孢菌感染症的预防和治疗受到越来越多的重视。CP7菌株的发酵上清液有Cpacin抗菌肽、多粘菌素类物质和β-1,3-1,4-葡聚糖酶等3种成分分别抵抗革兰氏阳性、阴性菌和真菌,本研究中的CP7ACP实际上包括以上3种物质在内的蛋白质混合物。本研究利用CP7ACP体外作用嗜水气单胞菌,研究表明CP7ACP能够抑制鱼嗜水气单胞菌在琼脂平板上生长,扫描电镜和透射电镜可明显观察到CP7ACP能够抑杀鱼嗜水气单胞菌。嗜水气单胞菌是革兰氏阴性菌,CP7ACP中抑制革兰氏阴性菌的成分是多粘菌素类物质。因此认为CP7菌株是嗜水气单胞菌的拮抗菌,其分泌的活性成分多粘菌素类物质能够强烈抑杀嗜水气单胞菌的生长,可以考虑通过进一步的研究开发应用于防治鱼嗜水气单胞菌引起的病害。