杆状病毒基因传递攻击的方法

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本文作者：万婧、周向阳、周秀锦、邵宏宏单位：舟山出入境检验检疫局

目前使用昆虫杆状病毒作为基因传递的载体用于基因治疗受到了广泛关注,其中研究最为深入的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedro-virus,AcMNPV)[1]。杆状病毒基因组较大且可操作性好,可以容纳多个基因或较大的基因,而且杆状病毒在哺乳动物细胞中不能复制,并对哺乳动物细胞有较高的转导效率,使得杆状病毒成为基因治疗的潜在载体。杆状病毒虽然能够在体外对多种细胞系实现有效的基因转导和表达,但其介导的体内基因转导却很少有成功的例子,这其中抑制杆状病毒介导的基因传递效率的主要因素是血清补体系统[2]。补体是构成宿主先天性免疫的重要组成部分,并在先天性免疫和适应性免疫之间起着一定的联系作用。补体可通过经典、替代和凝集素3条既独立又交叉的途径激活[3]。补体蛋白C1q可结合IgG或IgM分子的Fc区激活补体的经典途径。补体的C3蛋白自发地水解为C3a和C3b,C3b暴露出具有反应性的硫酯键,与病原表面的氨基和糖基进行共价结合从而引发补体的替代途径。当血清中存在的甘露糖结合凝集素(Mannan-bindinglectin,MBL)或纤维蛋白胶凝素(Ficolin)与细菌或病毒表面的甘露糖残基结合后,激活MBL-相关丝氨酸蛋白酶,进而激活凝集素途径。在所有途径中,补体蛋白水解引起一连串级联放大的连锁反应,导致溶膜复合物(Membraneattackcomplex,MAC)的形成而引起膜穿孔[3]。补体系统的级联激活受表面结合调节因子和可溶调节因子的严格控制,以免发生不适当的补体激活,导致宿主自身细胞受到损伤。表面结合调节因子包括补体受体1(Complementreceptor1,CR1)和补体促衰变因子(Decayacceleratingfactor,DAF),它们是引起C3b和C4b快速降解的辅因子,能阻止溶膜复合物的形成[34]。可溶调节因子如C4b-结合蛋白(C4BP)、H因子、FHL-1等,其中H因子和FHL-1是替代途径中的特异性调节因子,而C4BP是经典途径中的调节因子[5]。补体调节因子含有多个拷贝的短序列重复结构(Shortconsensusrepeats,SCRs)。许多哺乳动物病毒利用补体调节因子陷阱来逃避补体的攻击。而且一些病毒产生的可溶蛋白与宿主的补体调节因子的结构和功能极为相似,例如正痘病毒和牛痘病毒[6]。利用可溶的补体抑制剂sCR1能抑制人体血清对杆状病毒的灭活,使人们认为杆状病毒通过经典途径引起补体激活[2]。然而有研究表明,抑制补体激活的经典途径和凝集素途径仅仅提高了杆状病毒30%的存活率,将所有途径全部中和可以达到100%的存活率,而且杆状病毒在缺少了C1q蛋白的病人血液中的存活率仅有25%[7]。最近有研究人员利用体外血液循环系统进一步阐明了补体激活的机制,表明杆状病毒粒子可以与IgM和C3b结合[8]。上述结果表明替代途径和经典途径同时在杆状病毒失活过程中起作用。在此结合国内外研究进展,概述了杆状病毒逃避补体攻击的多种策略,使杆状病毒能够有效地介导基因传递而达到基因治疗的目的。

1免疫赦免位点作为基因传递的靶标体内存在一些称作免疫赦免的位点,例如眼睛、脑和睾丸,这些位点不能针对抗原产生适应性激活和先天性免疫反应[9]。

1.1眼睛对角膜和眼前房的免疫赦免已有数十年的研究,认为其可以避免眼睛发炎而造成组织受损或视力下降。眼睛中存在补体激活的替代途径和经典途径,但却受到多种补体调节因子,例如,DAF、MCP、CD59、I因子和H因子的严格控制,另外血眼屏障也限制了眼睛先天免疫系统的激活[10]。已有许多利用杆状病毒载体高效转导眼睛的报道。Haeseleer等首先利用表达GFP的杆状病毒通过玻璃体内注射和视网膜下注射小鼠眼睛,阐明了传递方法之间转导模式的差异[11]。视网膜下注射杆状病毒限制了视网膜色素上皮细胞的转导,而玻璃体内注射杆状病毒导致基因在角膜内皮、晶状体、视网膜色素上皮细胞和视网膜内表达。相似的研究证明,将杆状病毒通过玻璃体内注射兔眼后,视网膜色素上皮细胞、视网膜和光感受器细胞能够得到有效的转导[12]。另外有研究利用玻璃体内注射杆状病毒到大鼠眼睛,从内皮和神经元特异性的启动子来阐明转基因表达的特异性[1314]。这些结果表明杆状病毒介导的基因传递可能在治疗眼部疾病方面具有广泛的用途。

1.2脑由于血脑屏障、缺少淋巴流和免疫调节特性的居留细胞导致中枢神经系统的免疫赦免。研究表明免疫赦免仅限于软细胞组织,而不包括脑室、脉络丛、脑脊膜和脑室周围器官[15]。许多研究利用杆状病毒作为载体将基因传递到脑组织。Sarkis等证明纹状体注射杆状病毒后,能够转导大鼠和小鼠的神经系统的细胞,而且注射补体C3蛋白抑制剂——眼镜蛇毒因子的小鼠与对照组之间杆状病毒介导的基因传递无明显差异,因此该研究也首次证明了脑对杆状病毒转导的免疫赦免[16]。利用3个不同的立体定位图谱:一个接近侧脑室前角,一个是软细胞组织的内部和纹状体,进一步分析了杆状病毒介导的转导在小鼠脑内的偏爱性,结果表明对脉络丛上皮细胞和微脉管内皮细胞具有较强的偏爱性,而纹状体注射导致注射位点仅仅有很少的转导细胞,而且杆状病毒并未引起显著的小神经胶质反应和临床生化影响[17]。利用脑室内注射水泡性口膜炎病毒G蛋白胞外域(VesicularstomatitisvirusGpro-teinectodomain,VSV-G)假型化的杆状病毒后,发现侧脑室的上皮细胞、大脑导水管和蛛网膜的上皮细胞都能够检测到转基因的大量表达[18]。研究人员用VSV-G修饰的杆状病毒直接转导鼠脑皮层后发现该假病毒对血液补体有很大的抗性[19]。Boulaire等对大鼠的脑、人的星状细胞和神经元细胞注射杆状病毒后,描述了宿主的反应,其中针对杆状病毒的转导,星状细胞特异性的激活补体系统,选择神经元特异性的启动子可能避免转导星状细胞,而补体激活到何种程度才能影响体内转基因的水平以及持续表达的能力还有待进一步论证[20]。这些结果为临床治疗脑部疾病提供了光明的前景。

1.3睾丸血睾屏障物理性的将血管和输精管分开,使得睾丸也是一个免疫赦免组织[21]。目前利用杆状病毒将基因传递到小鼠睾丸组织的研究报告仅有两例:Tani等通过输精管传送表达GFP的杆状病毒,发现基部的细胞和塞尔托利细胞有转基因的表达[19];而Park等将杆状病毒注射到白膜,使得外部的输精管细胞有高水平的转基因的表达[22]。在研究中未检测到精母细胞和精细胞的转导,表明了杆状病毒可以被用来介导基因传递到睾丸组织,而且没有种系传播的风险。2体外转导为提高基因传递效率,亦可人工创造免疫赦免条件。研究人员将杆状病毒注射到兔颈动脉处的硅橡胶环内,避免了杆状病毒与血液补体的接触,使得外膜细胞内转基因的表达水平明显高于腺病毒介导的基因表达水平[23]。体外转导是隔绝补体的有效措施,首次理论论证的结果表明在人肝灌注模型处能检测到转基因的表达。研究报道可以利用杆状病毒将基因高效地传递到关节软骨细胞,这个过程需要骨形态发生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)的表达和旋转生物反应器培养基,证明杆状病毒可以在软骨和骨组织加工方面作为潜在的载体。将这种方式的软骨细胞加工应用到兔体时,可以在膝盖骨的凹槽处修复软骨缺陷[24]。Hu等首次证明了杆状病毒可以有效地转导人的间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)以及起源于MSCs的脂肪形成细胞的前体、软骨形成细胞的前体和成骨细胞的前体[25]。研究人员利用携带BMP-2的杆状病毒转导MSCs引起成骨细胞的分化,移植到裸鼠背部的皮下组织可导致异位骨的形成[26];而且在免疫兔体中利用表达BMP-2和VEGF的杆状病毒转导同种异系的MSCs时,可以增加股骨的部分骨缺陷的愈合[27]。已经证明杆状病毒载体也可以将基因高效地传递到人的胚胎干细胞。大量的研究工作证实杆状病毒的转导并不影响基因组的稳定性以及胚胎干细胞的多功能性。利用杆状病毒转导起源于人的胚胎干细胞的神经细胞有助于神经系统的移植,为治疗广谱的神经疾病提供了可能性[28]。最近,杆状病毒转导的MSC细胞被用来将自杀基因——胸苷激酶传递到异种移植肿瘤[29]。这些结果表明了利用杆状病毒作为体外治疗载体的巨大潜在可能性。

3补体的药理抑制剂

利用补体的药理抑制剂灭活补体,可以避免杆状病毒的失活。利用补体C3蛋白抑制剂——眼镜蛇毒因子处理血清后,再进行基因转导能够抑制补体对杆状病毒的灭活作用。进一步研究证明,利用能结合C3b和C4b的可溶性补体抑制剂sCR1处理人血清时,杆状病毒的存活率呈现剂量依赖性[2]。Tani等利用补体B和C1蛋白的抑制剂FUT-175,也能恢复杆状病毒的体内基因转导活性[19]。到目前为止,利用补体的药理抑制剂进行体内研究的报道仅有两例。Sarkis等通过纹状体注射杆状病毒后,再用眼镜蛇毒因子预处理,结果发现预处理的小鼠和对照组之间无明显差异,揭示了脑的免疫赦免足以保护载体免受失活[16]。2005年,研究人员对小鼠的门静脉注射高滴度的杆状病毒,通过服用sCR1的处理组和对照组来证明体内补体激活的重要意义[7]。结果发现对照组的小鼠全部死亡,而处理组小鼠的2/3存活且存在较低水平的转基因表达,进一步实验证明降低病毒的剂量可以降低免疫反应的激活。而且两组小鼠的肝组织学揭示了肝坏死和出血区域可能与补体系统的激活有关。当对小鼠注射高滴度的杆状病毒时,其肝出血和死亡是否是由于血液凝固引起的有待进一步研究论证。这些研究结果说明进一步寻找合适的补体抑制剂对于降低免疫反应具有重要意义,也突出了未来临床治疗上剂量选择的重要性。Georgopoulos等在人的体外血液循环系统中评估了两种补体抑制剂的效果:C3裂解的抑制剂和C5a受体拮抗物(C5areceptorantagonist,C5aRA)[8]。两种抑制剂均能引起细胞炎症因子释放的减少,与C3裂解的抑制剂相反,C5aRA却不能拯救杆状病毒的失活,表明在MAC的形成过程中C5b较C5a起了更重要的作用。此外,在体外血液循环系统中注射病毒和C3裂解的抑制剂后,发现血液细胞中的补体激活级联反应明显降低。注射杆状病毒可引起肉眼可见的血块凝固,加入抑制剂后可完全抑制血块的形成。由此可见,C3裂解的抑制剂可以有效地抑制补体激活、炎症因子的释放和血块的凝固,这些特性使其有望成为临床应用杆状病毒的有效抑制剂。

4杆状病毒的表面加工

通过遗传和化学方式加工杆状病毒也可以在基因传递的过程中避免补体的攻击[3031]。可以对杆状病毒粒子表面进行加工,例如当病毒粒子从昆虫细胞膜出芽时,可以将过表达的跨膜蛋白组合到病毒粒子的表面。同样的,可以将感兴趣的多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示于病毒粒子的囊膜上。通常将这种技术称作杆状病毒展示技术,这个真核展示平台在药物开发、疫苗和基因传递方面具有广泛的应用[32]。将杆状病毒的囊膜糖蛋白GP64作为融合伴侣是目前应用最为广泛的表面加工技术[33]。GP64是病毒结合和进入细胞必不可少的蛋白,也是依赖低pH从核内体中脱去核衣壳,以及随后从昆虫细胞中出芽不可或缺的蛋白。为了避免由于GP64的修饰而可能导致病毒感染力下降问题的出现,研究人员也在探寻其他的表面展示技术,VSV-G即是其中一种[30]。已有研究证明,对病毒粒子进行化学修饰也是一种有效的表面加工技术[34]。

4.1聚合物包被聚合物能保护载体免受血液补体的识别,这种方法也被应用到杆状病毒上。杆状病毒表面带有负电荷,因此可以用带正电荷的聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)包被病毒粒子,这种包被依赖于病毒粒子和聚合物之间的静电相互作用[31]。在50%的人血清中PEI可以使10%的载体免受补体的破坏,而在小鼠血清中可以达到100%。在感染复数为100,不超过0.2nmolPEI/106病毒粒子的比率时,转导杆状病毒不会引起细胞毒素的副作用。研究报道,PEI包被的杆状病毒在肝和脾脏的转导效率明显高于未包被的病毒,而且在裸鼠模型中,包被的杆状病毒能高效地抑制人异种移植肿瘤的生长。半乳糖化的PEI1800与PEI效果一致,却提高了杆状病毒在10%血清中的稳定性[35]。已有研究发现,利用另一种聚合物——聚乙烯乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)修饰杆状病毒能提高基因在体外、鼠脑和肺中的转导效率,而且聚乙二醇化的程度低于36.5%时对病毒的感染性影响最小[36]。此外,叶酸-PEG修饰杆状病毒后在体外表现出受体特异性的基因转移,而且能抑制人表皮癌异种移植模型中肿瘤的生长[34]。尽管未对聚乙二醇化杆状病毒的血清稳定性进行研究,但是上述结果足以证明聚乙二醇化可以逃避免疫系统,并延长生物分子的循环时间[37]。然而,在利用PEI和PEG聚合物时,为保证病毒的感染性和较低的细胞毒性,需要对聚合物的尺寸以及聚合物与病毒粒子的比率进行最优化处理。

4.2假型化批次之间的差异以及保证病毒的感染性需要大量优化工作,这两方面限制了化学修饰的应用。从遗传学角度对载体进行加工,避免补体的攻击是一个理想选择。假型化是利用其他病毒表面蛋白替换病毒自身囊膜蛋白的过程,目前已被证明可以缓和补体攻击的问题。VSV-G假型化的杆状病毒应用最为广泛,研究表明无论在体内还是体外,VSV-G都提高了杆状病毒的转导效率[19]。与未修饰的的杆状病毒相比,VSV-G假型化的杆状病毒对人、兔、猪、大鼠、仓鼠和小鼠的血清补体都显示出较强的抵抗力。这些结果与VSV-G假型化的逆转录病毒和慢病毒的研究结果一致[3839]。研究证明在gp64-敲除型的杆状病毒中,VSV-G和麻疹病毒受体CD46可以在一定程度上代替GP64的功能,使得杆状病毒能够在昆虫细胞中复制和传播[4041]。Barsoum等首先假定VSV-G假型化的杆状病毒可以抵抗补体的攻击,通过尾静脉注射VSV-G假型化的杆状病毒后,发现在小鼠肝细胞中有转基因的表达[42]。研究人员进一步实验证明,直接肌肉注射VSV-G修饰的杆状病毒有一部分不被补体系统中和,提高了基因传递到小鼠四头肌的效率[43]。Kaikkonen等表明共展示VSV-G蛋白的一个短的跨膜片段与完整的VSV-G一样可以保护杆状病毒免受补体的攻击[30]。上述结果表明,对杆状病毒的囊膜进行修饰,可以改变其免疫特性,而共展示异种囊膜蛋白提供补体保护的机理有待进一步研究。

4.3表面展示补体抑制剂通过遗传方式在病毒粒子表面展示补体调节蛋白,这样可以增加杆状病毒载体在血清中的稳定性,第一个被展示的补体调节蛋白是DAF[44]。展示DAF-GP64融合蛋白的杆状病毒可以高效转导补体充足新生鼠的肝软细胞组织,而对成鼠直接肝内注射后,发现转导效果一般。研究人员证明了展示DAF的保护特性,并且评估了其他补体调节蛋白以及不同组合间逃避补体攻击的效率,例如FHL-1、C4BP和MCP[30]。杆状病毒在血清中的稳定性依赖于展示的补体调节蛋白和血清的来源,研究证明70%的小鼠血清以及13%的大鼠血清具有最佳的防护效果,将病毒粒子与50%的人血清孵育1h后,大约30%的病毒粒子仍能够转导HepG2细胞。通常细胞表面结合的DAF和MCP能较好地阻止补体激活,而同时共展示几种补体调节蛋白达不到更好的效果。先前研究表明门静脉注射高剂量未经修饰的杆状病毒对小鼠是致死的,而门静脉注射抑制补体攻击的杆状病毒能安全将基因传递到靶器官,与补体的药理抑制剂相似,展示DAF提高了小鼠的存活率[7,30]。越来越多的证据表明补体系统和Toll-样受体(Toll-likereceptors,TLR)之间存在大量的串扰现象,例如,在缺失DAF的小鼠中检测到白介素1-b(Interleukin-1b,IL-1b)和白介素-6(Inter-leukin-6,IL-6)在TLR的刺激下显著增加,表明了TLR引起的细胞因子反应对补体系统具有调节作用[45]。有趣的是,携带DAF的杆状病毒与巨噬细胞孵育后,与对照相比,发现诱导产生的炎症性细胞因子明显减少。已经证明,补体的激活可以引起血液凝固,当高剂量的杆状病毒接触到血液也会引起这种现象。研究报道,展示DAF-VSV-GED能降低补体的激活和炎症反应,也有可能降低血栓形成的风险。对表面展示补体抑制剂的不断研究势必会促进杆状病毒作为基因传递载体的广泛应用。

5结论与展望

杆状病毒在哺乳动物细胞中不能复制,以及对哺乳动物细胞较高的转导效率使它成为基因治疗中越来越有吸引力的载体[46]。然而,杆状病毒对人体血清中的补体系统高度敏感,要使杆状病毒载体在基因治疗中得到广泛应用,必须克服补体系统的攻击。避免补体系统攻击的被动措施包括：将免疫赦免组织作为基因传递的靶标和体外转导,这些措施被证明有潜在的应用价值,但是在临床上不能广泛使用。在未来的发展中,补体的药理抑制剂有望以混合物的方式获得广泛应用,例如C3裂解的抑制剂,然而在基因治疗中抑制补体的潜在副作用有待进一步评估[47]。因此,最理想的选择是对载体自身进行加工,使其避免补体的攻击,研究证实PEI包被和展示DAF的杆状病毒具有巨大的应用潜力。杆状病毒载体引起补体激活的分子机制仍不明确。C3b与蛋白抑制剂或者细胞表面的唾液酸结合就能失活,而杆状病毒粒子缺少这些抑制蛋白,由于昆虫宿主细胞检测不到唾液酸转移酶的活性,因此杆状病毒也不携带唾液酸,所以不能失活C3b,也就容易被补体系统失活[3]。在能够表达唾液酸的昆虫细胞中生产展示DAF的杆状病毒可能会更好地逃避补体的攻击。明确杆状病毒激活补体的详细机理,对将来设计更高效的杆状病毒载体以及基因治疗的临床应用具有重要意义。