鉴定藏灵菇菌

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本文作者：孙婷、王芳、李梅花、孙春玲、刘文俊、于洁、张家超、张和平单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

藏灵菇又称“西藏灵菇”,是一种乳白色、胶质块状物,外形酷似米粒,上面栖息着多种微生物,能在乳中快速生长,并集结成块,看起来很像雪莲,也称“西藏雪莲”[1]。据相关文献记载,“西藏雪莲”主要具有以下功效:(1)可以加速唾液、胃酶及胰酶的分泌,增强食欲和帮助消化。(2)乳酸菌分解糖所产生的乳酸和醋酸,具有使肠内pH下降,抑制腐败菌和病原菌繁殖,从而抑制小肠腐败。微量的乙醇可以促进新陈代谢,使循环系统及神经系统的活动正常化,对于胃肠病、代谢异常病有较好的治疗与预防作用。(3)能够降低胆固醇,有效防止高血压、冠心病等心血管疾病的发病率。(4)其活性物质成分以及微生物所形成的抑制致病菌的抗菌性物质能抑制癌症的发生及癌细胞增殖[24]。目前对藏灵菇的研究还属于起步阶段,相关的报告并不多,根据一些相关文献的报道藏灵菇中主要的微生物是乳酸菌和酵母菌,其中乳酸菌包括开菲尔乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌;酵母菌包括啤酒酵母、假丝酵母、克鲁维酵母、单孢酵母等[5],同时也有部分文献报道过藏灵菇中含有醋酸菌[6],肖琳琳等人从藏灵菇中分离出多株乳球菌、乳杆菌和酵母菌,并从中筛选出一株能高效降解胆固醇的干酪乳杆菌[7],刘变芳等人也从藏灵菇中分离出乳杆菌、乳球菌及酵母菌[8]。然而,近年来对藏灵菇中乳酸球菌的研究比较少,特别是运用多种方法研究其中乳酸球菌成分的更少,即使有些文献报道,但其研究手段主要采用传统的鉴定方法。本研究采用传统的生理生化试验与16SrRNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)、16S-23SrRNA间区序列多态性分析等分子生物学技术相结合的多项分类手段对藏灵菇中的乳球菌进行了鉴定和研究,期望更全面、准确地对藏灵菇中乳酸球菌进行分离、鉴定和优势菌群分析。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品来源及模式菌株:2份藏灵菇样品采集于西藏日喀则地区江孜县东郊乡和西藏那曲县桑雄乡。本试验以购买自美国模式菌种培养物保藏中心(ATCC)的EnterococcusduransATCC19432作为试验的参考菌株。

1.1.2各种培养基与试剂:改良MRS琼脂培养基配方(g/L):大豆蛋白胨10,牛肉浸取物10,酵母提取物5,葡萄糖20,乙酸钠5,柠檬酸三钠2,吐温1,磷酸氢二钾2,七水硫酸镁0.2,七水硫酸锰0.054,琼脂15,放线菌酮1×103,蒸馏水1L。在原有配方中添加1g/L的放线菌酮从而达到抑制真菌生长的目的。TPY液体培养基,BLB液体培养基,以及其它生理生化试验和糖发酵试验所用培养基和试剂,参照文献[9]配制。

1.1.3试验主要仪器:试验主要仪器:变性梯度凝胶电泳仪、PTC-200型梯度基因扩增仪,伯乐公司;电泳仪,Appliedbiosystem公司;TGL-16B高速离心机、TGL-16G-A型高速冷冻离心机,安亭公司;ND-1000型微量紫外分光光度计,Eppendorf公司;MLS-3780型全自动高压蒸汽灭菌器,三洋公司;HHSI-NI恒温水浴槽,北京长安科学仪器厂;DHP-9272电热恒温培养箱,上海雷韵试验仪器制造有限公司;DOC2000型UPV凝胶成像分析系统,北京六一仪器厂;本试验所用引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成,具体引物序列见表1。

1.2方法

1.2.1菌株分离及保存:取经过初步培养后的藏灵菇发酵乳1mL,用生理盐水依次稀释至105、106、107倍,每个稀释度取0.1mL涂布于改良MRS琼脂培养基,37°C厌氧培养48h,然后随机选取典型菌落,进行培养、涂片、革兰氏染色、镜检、过氧化氢酶实验。凡过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性的球菌初步定为乳酸菌球菌,继续在相应的培养基上划线纯化,如此重复3次,直至镜检为纯培养物。将纯化后的菌株于真空冷冻进行保存。

1.2.2乳酸菌球菌的生理生化鉴定:重新活化初步鉴定为乳酸球菌的菌株,据参考文献[911]对供试菌株进行生理生化试验和糖发酵试验,对照菌株为LactobacilluscaseiATCC393、Lactococcuslactissubsp.cremonsATCC19257,由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

1.2.3菌株基因组DNA的提取:将供试菌株采用改良的CTAB-冻融方法提取菌株基因组DNA[12],即用液氮反复冻融后进行提取。

1.2.4变性梯度凝胶电泳:PCR扩增选用引物V3F和V3R[13],对供试菌株和参考菌株的16SrRNA基因的V3区进行扩增,选用引物V3FG+C和V3RG+C[14]。扩增反应体系(50μL)含如下成分:基因组DNA模板约50ng;dNTP(2.5mmol/Leach,TaKaRa)2μL;两条引物V3FG+C和V3RG+C的终浓度均为0.4mol/L;1.5UDNATaq聚合酶(TaKaRa)0.5μL;10×PCRBuffer5μL。扩增反应程序:94°C5min;94°C40s,65°C50s,0.5°C循环,72°C3min,共20个循环;94°C40s,55°C50s,72°C3min,共10个循环;72°C7min。将300ng扩增产物于8%的聚丙烯酰胺胶上进行分离,变性剂梯度范围为27%52%(100%的变性剂包含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)。电泳在恒温60°C下1×TAE缓冲液中进行,电压200V,时间4h。电泳结束后进行银染并对电泳图谱进行分析。将银染后的凝胶条带小心切下,溶于100μLTE溶液中,过夜后取3μL该溶液作为再次扩增的模板,使用不含GC夹子的V3区引物进行扩增,而后将扩增产物测序。

1.2.516S-23SrRNA间区序列多态性分析:以供试菌株的DNA为模板,应用16S-23SrRNA间区引物L1和G17[15]进行PCR扩增。扩增反应体系(25μL)含如下成分:基因组DNA模板约50ng;dNTP浓度为200μmol/L;两条引物L1和G17的浓度均为10pmol/L;DNATaq聚合酶1.5U;1×PCRbuffer。扩增反应程序:94°C2min;94°C30s,54°C30s,72°C1min,共30个循环;72°C8min[16]。扩增16株供试菌株和1株参考菌株的16S-23SrRNA间区序列。将扩增产物用2%的琼脂凝胶在电压60V的条件下电泳3h,而后将电泳凝胶用溴化乙锭(EB)染色并分析电泳结果。

1.2.616SrRNA基因序列分析:使用实验室自主设计的引物A27F和A1495R对参考菌株的16SrRN段进行扩增,菌体扩增条件如下:94°C5min;94°C1min,58°C1min,72°C2min,共30个循环;72°C10min。将扩增成功的PCR产物寄往上海桑尼生物科技有限公司测序,将测序结果运用DNAstar软件进行序列拼接、校准、排齐。然后上传到NCBI数据库并BLAST比对,最后应用MEGA4.0软件制作系统发育树并完成同源性分析。

2结果与分析

2.1乳酸球菌的传统方法鉴定结果将革兰氏阳性,过氧化氢酶试验阴性的球菌进行生理生化试验,试验结果如表2、表3所示,根据参考文献[911]将16株菌株归为3个菌群:片球菌群、乳球菌群和肠球菌群。其中14株菌株都能在10°C、45°C、pH4.5、pH9.0、6.5%NaCl环境下生长,部分菌株能从精氨酸中产生NH3,大多数菌株能利用乳糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、麦芽糖等,所以将14株菌株初步鉴定为肠球菌群(Enterococcus)。另外IMAU60189与片球菌属的生理生化性质相似,初步鉴定为片球菌群(Pediococcus),IMAU60193与乳酸球菌属的生理生化性质相类似,所以初步鉴定为乳球菌群(Lactococcus)。

2.216S-23SrRNA间区序列多态性分析为了进一步将菌株鉴定到种的水平,对分离到的16株菌进行了16S-23SrRNA间区序列多态性分析。从图2可以看出Lane1,Lane12与所选用耐久肠球菌的模式菌株处于不同的位置,而其它菌株的条带与模式菌株处于相同的位置。

2.3变性梯度凝胶电泳分析结果为了验证上述方法的准确性,本试验又采用变性梯度凝胶电泳分析对16株菌株进行了鉴定。从图3可以看出IMAU60193(Lane1),IMAU60189(Lane12)的条带与参考菌株的条带不在同一位置,而其他菌株的条带与参考菌株处于同一位置,与16S-23SrRNA间区序列多态性分析结果是一致的,所以我们将银染后的凝胶不同位置的条带切割回收并对其进行测序。通过测序可知Lane1的IMAU60193为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactissubsp.lactis),Lane12的IMAU60189为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

2.416SrRNA基因序列分析将试验中分离到的16株菌进行了16SrRNA基因测序,测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索(BLAST),并采用软件构建系统发育树,比较已测序菌株与模式菌株的亲缘关系,如图3所示,从图中可以看到14株分离菌株与耐久肠球菌的模式菌株亲源性较近,IMAU60193与Lactococcuslactissubsp.lactis的模式株亲缘性较近,IMAU60189与Pediococcusacidilactici的模式株亲缘关系较近。试验结果与DGGE测序结果相一致。

3讨论

藏灵菇的多种保健作用,如藏灵菇具有抗炎症作用[17],藏灵菇奶对慢性肠道疾病功能调节作用[18],所以目前国内外对其微生物组成进行了一定的研究,藏灵菇中菌系十分复杂,但主要菌种为乳酸球菌、乳酸杆菌、醋酸菌和酵母菌,这些菌株相互依存在藏灵菇中形成了共生体系。而对藏灵菇中微生物的分离鉴定还是主要采用了传统的生理生化试验,但是由于藏灵菇中微生物菌群的复杂性,仅用传统的方法还是无法准确地分析藏灵菇中微生物的结构,因此在本次试验中我们采用了多项分类方法对藏灵菇中的乳酸球菌进行了鉴定,从而有效地弥补了传统方法的缺陷,更准确的对其进行了鉴定。本试验主要对西藏雪莲中的乳酸球菌进行了分离,从2份样品中分离得到了14株耐久肠球菌、1株乳酸片球菌、1株乳酸乳球菌乳酸亚种,从试验结果可以看出耐久肠球菌是藏灵菇中的优势菌株,在相关的文献中还未发现类似的报道,其他2菌株与相关文献报道基本相同,表明不同来源的藏灵菇中优势菌群种类可能存在差异。肠球菌为革兰氏阳性球菌,是一种条件致病菌,可引起心内膜炎、菌血症、尿道感染等疾病,且具有抗生素抗性。但是一些能产生细菌素的肠球菌却可以作为益生菌应用于人们的日常生活中[19],作为一种食品中常见的乳酸菌,在肉制品和其他发酵食品中也可能起着重要作用。安全性是肠球菌应用中的首要问题,因此采用不同的方法准确鉴定耐久肠球菌在日常生活中有着重要的意义。由于耐久肠球菌的鉴定具有实际意义,所以选用准确的方法就尤为重要,目前还是主要应用传统的分离纯化鉴定方法,需要进行一系列繁杂的形态特征和生理生化试验,却不能对分离物进行精确的鉴定,不能反映分离物间的系统发育关系[2022],所以本试验主要采用了传统的鉴定方法和不同的分子生物方法相结合的多项分离鉴定方法对藏灵菇中的乳酸球菌进行了鉴定。从本次试验结果中可知传统的生理生化试验可以将分离到的菌株鉴定到菌群的水平,由于一个菌群中包含了多个种和亚种,其中有些种和种之间,种和亚种之间的一些生理生化性质也很相似,所以仅根据一些生理生化性质我们无法准确的鉴定到种的水平,甚至是亚种的水平,而rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标,它含量大(约占细菌RNA总量的80%),并存在于所有细菌中,而且16SrRNA序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法,大约2500个种的16SrRNA全序列已经被报。而且rRNA基因序列既具有保守性,又具有高变性,是目前细菌分类和鉴定中经常测定的序列。

其中16S-23SrRNA间区序列多态性分析、DGGE、16SrRNA序列分析作为近几年主要的分子生物方法,这些分子生物方法可以很好地解决传统的生理生化试验无法准确鉴定到种的水平的缺陷。从16S-23SrRNA间区序列多态性分析、DGGE电泳条带中可以看到这两种方法能有效快速的将16株菌株区分成3个不同的种,并通过16SrRNA基因测序最终将16株菌株全部准确的鉴定到种的水平。因此传统的生理生化试验并不能作为菌种分离鉴定的主要方法,而16S-23SrRNA间区序列多态性分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16SrRNA基因测序可适用于藏灵菇中乳酸球菌菌种之间的鉴定。藏灵菇可以作为天然发酵剂使牛奶变成酸奶,这种发酵剂含有多种乳酸菌和酵母菌,本文应用传统生理生化和多种分子生物学方法相结合的惰性分类手段对藏灵菇中的乳酸球菌进行了准确鉴定和全面、可靠的研究,为研究和开发天然菌种发酵剂的乳酸菌资源奠定了良好的基础。