稻曲病菌脂肪酸研究

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本文作者：任佐华、毛莹、虞选杰、李媛、刘二明单位：湖南农业大学生物安全科学技术学院

脂肪酸是细胞壁和生物膜的重要组成成分,生物膜是生物体能感受外界环境因素变化的受体,生物膜上的生理、生化及物理性质的改变最快最明显的反应了环境对生物的影响[1],不同种类脂肪酸组成和含量的变化与生物的抗逆性有密切关系[2]。脂肪酸根据其饱和度不同,可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸又可分为一价不饱和脂肪酸如油酸,棕榈油酸等,和多价不饱和脂肪酸如亚油酸、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等[3]。多价不饱和脂肪酸是生物膜的重要组成成分,可以调节动态平衡、细胞构型、细胞膜的渗透性;具有调节某些基因表达的作用,如调节编码脂肪酸合成酶;同时还可以参与膜相关的生理过程,如细胞识别、脂代谢、免疫调节等[4],此外,还可用作食品添加剂、营养配方、健康辅料以及保健品等[5]。研究还表明微生物细胞脂肪酸的种类与数量构成与微生物的分子特征、遗传变异、致病性及其耐药性有密切的关系[6]。稻曲病是由真菌稻绿核菌[Ustilaginoideavirens(Cooke)Takahashi]引起的水稻穗部重要病害[7]。稻曲病以菌核或厚垣孢子的形式越冬,水稻病粒上的稻曲球外围的厚垣孢子,在病情发展过程中厚垣孢子渐渐由黄色转变为黄绿色:黑色为休眠型、黄色为非休眠型,绿色为休眠与非休眠过渡态[8]。在真菌脂肪酸研究中,戴传超通过研究环境因子对乌柏内生真菌生长及脂肪酸的影响发现在内生菌生长受到抑制的情况下,其脂肪酸不饱和指数增加[9]。陆合等研究逆境对真菌膜脂肪酸成分的影响时发现不同逆境胁迫条件下,真菌中膜的脂肪酸含量不一样[10]。黄大庆通过检测球孢白僵菌脂肪酸种类和含量,揭示了脂肪酸与毒力存在的相关性[11]。然而,稻曲病厚垣孢子在不同颜色转变过程中,休眠型与非休眠型的厚垣孢子脂肪酸的组成和含量有何变化,迄今还未见报道,本文为了揭示稻曲病菌厚垣孢子的内源性休眠机制,运用气相色谱检测了不同颜色厚垣孢子脂肪酸的组成和含量。

1材料与方法

1.1实验材料2009年9月于怀化市洪江市湾溪乡和丰村采集水稻品种两优396上的典型黄色、黄绿色和黑色稻曲病菌厚垣孢子,40°C低温冰箱中保存备用。脂肪酸标准品SupelcoTM37ComponentfattyacidmethylestermixturecatalogNO.47885-U购买于Sigma公司,其它药品均为国产分析纯。

1.2破壁与厚垣孢子壁的提取3种不同颜色稻曲病菌厚垣孢子粉各称取1000mg,分别采用液氮研磨-超声破处理方法破壁[9],15000r/min离心5min,将上清液和沉淀分别0.1Pa、50°C真空干燥24h[12]。

1.3脂肪酸的提取1.3.1酸热法:称取450mg破壁后的厚垣孢子壁,加入6mL4mol/L的HCl振荡2min,室温放置30min,沸水浴3min,20°C速冷,加入12mL氯仿:甲醇(1:1,V/V)提取液,振荡5min,10000r/min离心5min,取氯仿层,加入12mL0.1%NaCl溶液,混匀,10000r/min离心5min,取氯仿层挥发除去氯仿即得油脂[13]。

1.3.2索氏提取法:称取450mg破壁后的厚垣孢子壁,用滤纸包裹后装入索氏提取器,石油醚加热回流提取6h,旋转蒸发去除石油醚即得油脂[13]。1.3.3有机溶剂法:称取450mg破壁后的厚垣孢子壁,加入3mL氯仿:甲醇(1:2,V/V)提取液,振荡2min,再加入1mL氯仿,振荡5min,再加入5mL水,振荡5min后10000r/min离心5min,取氯仿层,加入4mL0.1%NaCl溶液,混匀,10000r/min离心5min,取氯仿层,挥发去除氯仿即得油脂[13]。

1.4脂肪酸甲酯化称取20mg粗脂置于试管中,加入1mL1mol/LKOH-甲醇溶液,在40°C水浴中反复振摇30min,静置15min,置入70°C水浴中将其蒸干,加入2mL5％H2SO4甲醇溶液,在70°C水浴中振摇6min,加入2mL正己烷,静置10min,取上清液,加入少许无水硫酸钠[12]。

1.5粗脂提取率测定孢壁粗脂提取率=(b/a)×100%a:干燥孢壁重450mg;b:450mg厚垣孢子壁中的粗脂含量(mg)。孢壁内粗脂提取率=(c/t)×100%c:上清液中粗脂含量(mg);t:1000mg厚垣孢子粉(mg)。1.6脂肪酸的种类及其含量测定采用气相色谱-质谱(GC-MS)法[12]。气相色谱条件:Agient气相色谱仪;HP-5毛细管柱(30.0m×0.32mm×0.25μm);进样口温度:250°C;FID温度:280°C;柱温:初始温度110°C,15°C/min升温至230°C,保持40min;线速度:33cm/s;分流比:5:1,H230mL/min、N230mL/s,尾吹30mL/min、air30mL/min、进样量:1μL。

2结果

2.1不同提取脂肪酸的方法比较有机溶剂法与酸热法相比较操作更为简单,但提取得到的两种形态厚垣孢子的饱和脂肪酸含量以及不饱和脂肪酸的含量均低于酸热法;索氏提取法操作耗时较长,黑色厚垣孢子不饱和脂肪酸的提取含量均低于其它两种方法(表1)。在3种方法中,以酸热法提取最佳。

2.2不同颜色厚垣孢子粗脂提取率用酸热提取方法测定3种不同颜色厚垣孢子壁和细胞总脂肪酸组成与含量。因为要测定整个厚垣孢子的脂肪酸的组成及其含量,离心后沉淀中的主要成分是厚垣孢子壁的提取物,而离心后的上清液中还含有厚垣孢子壁的内容物,所以对离心后上清液的脂肪酸含量一并进行测定。不同颜色厚垣孢子的脂肪酸含量不同,即得到的粗脂含量也有差异,其平均粗脂提取率:黄色厚垣孢﹥﹥子黄绿色厚垣孢子黑色厚垣孢子(表2)。

2.3不同颜色厚垣孢子脂肪酸的组成及其含量差异比较以优选的酸热法提取脂肪酸测定出:黄色厚垣孢子壁有20种脂肪酸,饱和脂肪酸有9种,不饱和脂肪酸有11种,其中主要成分是十八油酸、亚麻油酸,分别占总脂肪的25.24%、27.38%。整个黄色厚垣孢子有20种脂肪酸,饱和脂肪酸有9种,不饱和脂肪酸有11种(表3)。黄色厚垣孢子壁饱和脂肪酸相对含量26.92%,不饱和脂肪酸相对含量60.46%;黄色厚垣孢子饱和脂肪酸相对含量28.87%,黄色厚垣孢子不饱和脂肪酸相对含量55.43%(表4)。黄绿色厚垣孢子壁有19种脂肪酸,饱和脂肪酸有9种,不饱和脂肪酸有10种,其中主要成分是:十八油酸、亚麻油酸酯,分别占总脂肪26.71%、25.26%。黄绿色厚垣孢子有19种脂肪酸,饱和脂肪酸有9种,不饱和脂肪酸有10种(表3)。黄绿色厚垣孢子壁的饱和脂肪酸相对含量17.23%,不饱和脂肪酸相对含量61.52%;厚垣孢子饱和脂肪酸相对含量21.00%,不饱和脂肪相对含量55.87%(表4)。黑色厚垣孢子壁有20种脂肪酸,饱和脂肪酸有9种,不饱和脂肪酸有11种,其中主要成分是十八油酸、亚麻油酸,分别占总脂肪的25.67%、20.78%。黑色厚垣孢子有22种脂肪酸,饱和脂肪酸有11种(表3)。厚垣孢子壁饱和脂肪酸相对含量是23.71%,不饱和脂肪酸相对含量70.64%;厚垣孢子饱和脂肪酸相对含量24.04%,不饱和脂肪酸相对含量63.89%。不饱和脂肪酸有11种,其中饱和脂肪酸十三酸、二十三酸是黑色厚垣孢子内容物所特有的脂肪酸(表4)。各种颜色厚垣孢子均不含饱和脂肪酸C6、C8、C10、C11和不饱和脂肪酸顺式-4,7,10,13,16,19二十二碳六烯酸(DHA)(表3)。

3讨论

(1)在酸热法、有机溶剂法、索氏提取法对稻曲病菌厚垣孢子壁脂肪酸进行的提取中,有机溶剂法较为简单且易操作;酸热法提取下,两种形态厚垣孢子的饱和脂肪酸含量以及不饱和脂肪酸的含量均高于有机溶剂提取下的含量。其原因可能是有机溶剂未能有效的破坏脂肪酸与其它大分子物质之间的共价键。索氏提取法是较为常见的方法,但其耗时较长,而且,黑色厚垣孢子不饱和脂肪酸的含量较之其它两种方法低。酸热法在有机溶剂法的基础上加入沸水浴及速冻处理,使得脂肪酸与其它大分子物质的共价键遭到破坏,因此,能检测出更多的脂肪酸。(2)长链多不饱和脂肪酸是生物膜组成成分,起到维持细胞正常功能和增加机体抗逆性的作用[214]。不饱和脂肪酸例如十八油酸和亚麻油酸的含量在厚垣孢子颜色转变的过程中逐渐增多,并且不饱和脂肪酸二十四碳烯酸只存在于黑色厚垣孢子壁中,推测原因可能是不饱和脂肪酸是细胞膜和线粒体膜的组成成分,而厚垣孢子在休眠过程中为了适应低温环境,必须通过提高壁中脂肪酸的不饱和程度来增加孢子膜的流动性,进而保证整个孢子进行正常的生理活动。(3)在真菌中不饱和脂肪酸是以饱和脂肪酸硬脂酸为底物,经碳链的延长和脱饱和2个反应而来[1516]。饱和脂肪酸硬脂酸在黄色厚垣孢子壁中的含量最多,黄绿色厚垣孢子壁中的含量较少,黑色厚垣孢子壁中的含量最少,原因可能是:1)黄色厚垣孢子萌发率较高,而萌发时在油脂的环境中,需要消耗能量[13];2)不饱和脂肪酸的产生对饱和脂肪酸产生抑制调节,从而导致饱和脂肪酸的含量逐渐降低[17]。(4)休眠型的黑色厚垣孢子与非休眠型的黄色厚垣孢子和介于休眠和非休眠中间型的黄绿色厚垣孢子相比,无论是孢子壁,还是孢子总的不饱和脂肪酸含量均含量最高;李博等人通过生长温度对内陆土壤冷适应细菌膜脂的脂肪酸组分影响研究发现一些嗜冷细菌可通过快速增加脂肪酸的不饱和度来适应低温环境[18]。由此可推断不饱和脂肪酸的含量提高,有利于厚垣孢子的休眠越冬。