小龙虾研究论文：小龙虾5-HT与DA分布研究
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本文作者：魏华1,2沙晓姣1陈阿琴1唐建清3夏爱军3作者单位：1上海海洋大学水产与生命科学学院2上海农林职业技术学院3江苏省淡水水产研究所
结果
Ⅰ期卵巢5-HT阳性物质主要集中在卵母细胞胞质(阳性细胞呈棕色)，胞核未出现阳性反应。Ⅱ～Ⅳ期5-HT阳性物质主要集中在卵母细胞胞质以及胞核(图1)。Ⅰ～Ⅱ期卵巢中DA阳性物质均分布于卵母细胞的胞质与胞核，Ⅲ～Ⅳ期阳性物质只在胞核(图2)。克氏原螯虾的肝胰腺由许多具有盲端的肝小管组成，肝小管主要由胚细胞(E)、泡状细胞(B)、吸收细胞(R)和纤维细胞(F)4种上皮细胞构成［17］。在各个发育时期，肝胰腺中5-HT的免疫阳性物质主要分布在胚细胞(E)、泡状细胞(B)、吸收细胞(R)和纤维细胞(F)四类细胞的胞核和胞质，且胞核与胞质的阳性强度相当(图3)。在各个发育时期，肝胰腺中DA阳性物质主要分布在胚细胞(E)、泡状细胞(B)、吸收细胞(R)和纤维细胞(F)四类细胞的胞核和胞质，强度有递减趋势(图4)。设计的阴性对照未见免疫阳性反应(图5)。
2卵巢与肝胰腺中5-HT与DA的阳性强度
对各期克氏原螯虾卵巢和肝胰腺进行5-HT与DA免疫组化染色发现，5-HT与DA在不同卵巢发育期的卵巢和肝胰腺细胞阳性表达强度不同。根据DAB染色的深浅，分为强阳性、中等阳性、弱阳性、阴性，分别表示为“+++”、“++”、“+”、“－”［18］。Ⅰ期卵巢5-HT阳性物质主要在卵细胞胞核、卵原细胞胞核以及滤泡细胞，且均为强阳性，卵细胞胞质、卵原细胞胞质未见阳性分布。Ⅱ期、Ⅲ期卵巢卵细胞胞核与滤泡细胞均有阳性物质分布且为强阳性。Ⅳ期卵巢卵细胞胞核与滤泡细胞均呈强阳性，阳性位点减少。5-HT在各期肝胰腺细胞R细胞与B细胞中均有分布，且均为强阳性，Ⅲ～Ⅳ期肝胰腺F细胞5-HT呈强阳性表达(表1)。DA在卵巢与肝胰腺中的阳性强度与5-HT略有差别，Ⅰ期卵巢DA阳性位点分布在卵细胞胞质与胞核、滤泡细胞，强阳性，Ⅱ期卵巢阳性部位主要在卵细胞胞质与胞核、滤泡细胞，为强阳性，卵细胞胞质中的阳性位点数较Ⅰ期相对减少。Ⅲ期卵巢阳性位点分布在卵细胞胞核以及滤泡细胞，且均呈强阳性。Ⅳ期卵巢阳性位点分布在卵细胞胞核以及滤泡细胞，也为强阳性，阳性位点有减少的趋势。各期肝胰腺细胞均有DA的阳性物质分布，强度递减(表2)。
讨论
15-HT与DA在卵巢组织中的分布
本研究通过免疫组化技术研究了5-HT与DA在卵巢和肝胰腺中的分布。目前有关5-HT与DA在甲壳动物卵巢中的分布已有报道，但是在不同动物之间存在诸多差异，比如，5-HT在日本新糠虾Ⅰ～Ⅲ期卵巢中分布于滤泡细胞、卵母细胞胞质和卵母细胞核，Ⅳ期卵巢中未出现5-HT阳性细胞［18］。5-HT在斑节对虾Ⅰ～Ⅳ期卵巢中分布于滤泡细胞、卵母细胞和皮质棒［10］。本研究发现5-HT在克氏原螯虾卵巢主要分布于卵细胞胞质与胞核，且在胞核中总体呈递增趋势，与5-HT在斑节对虾卵巢发育中变化趋势相同，而与5-HT在日本新糠虾［19］发育卵巢中变化趋势相反。5-HT在克氏原螯虾卵细胞胞质强度亦呈递增趋势，与5-HT在日本新糠虾发育卵巢中变化趋势相反。Yotsawan等［19］使用免疫荧光法发现南美白对虾除卵巢组织外，在中央神经系统也有5-HT分布。Garnerot等［20］研究结果表明在双壳类的性腺与消化腺组织均有5-HT阳性物质的分布。南美白对虾Ⅰ期卵巢的DA阳性物质主要分布在早期卵黄合成期的卵母细胞胞质，而卵原细胞以及滤泡细胞中则无阳性细胞，Ⅱ～Ⅳ期卵巢仅在卵母细胞胞质有阳性细胞分布［9］。这与本研究结果DA在克氏原螯虾卵巢发育各时期的卵细胞中的阳性表达相似。罗氏沼虾［9］与南美白对虾［19］卵巢内5-HT含量随着卵巢发育呈上升趋势，DA含量随着卵巢发育呈下降趋势，且不同发育期间存在显著差异。本研究发现DA在克氏原螯虾卵母细胞呈递减趋势，与罗氏沼虾、南美白对虾发育卵巢中的DA含量变化趋势相同。综上所述，随着卵巢的发育，5-HT在卵母细胞中的分布呈递增趋势，DA呈递减趋势。这可能与所选材料的种类不同有关，也可能是因为卵巢组织除卵母细胞外，还有间质以及结缔组织等的存在［21］，本研究只是对克氏原螯虾卵巢组织卵母细胞做5-HT与DA的定量研究，关于这方面的研究还需完善。
25-HT与DA对卵巢发育的调节作用
利用高效液相色谱和免疫组化法已经从神经系统、卵巢和血淋巴中检测出5-HT和DA的分布，并且在锯缘青蟹脑、胸神经团和视神经节已检测出5-HT神经细胞［12］。本研究证实5-HT与DA阳性细胞在卵母细胞的分布随卵巢发育变化而变化，在卵巢与肝胰腺中，5-HT含量总体呈现递增趋势，DA含量变化正相反。提示5-HT与DA可能和卵巢发育之间的关系密切，证实5-HT对卵巢发育的促进作用，DA对卵巢发育的抑制作用。卵巢Ⅰ期，卵巢与肝胰腺组织中DA阳性强度基本相当，Ⅱ～Ⅳ期5-HT阳性强度稍高于DA。从Ⅱ期开始，卵巢、肝胰腺中5-HT在量上逐渐积累，DA含量降低。5-HT的促进作用占主导作用，卵巢逐渐趋于成熟。本研究结果中，卵母细胞和肝胰腺细胞DA阳性强度变化极其相似，均随卵巢的发育呈递减趋势。表明甲壳动物卵母细胞的发育与肝胰腺可能也有密切关系［17］，其调节机制还有待于进一步的研究。此外，一些其他激素也参与5-HT与DA对甲壳动物卵巢发育的调节，如Homola等［22］等在蜘蛛蟹大颚器的解聚细胞培养液中添加5-HT，结果显示10－8mol/L5-HT抑制了20%～30%甲基法尼酯(MF)的合成，表明5-HT作为神经调质调控MF的合成。Santhoshi等［23］发现，注射5-HT能显著提高印度明对虾体内卵黄蛋白原水平，Yotsawan等［9］认为注射DA显著降低了罗氏沼虾血淋巴内卵黄蛋白原的含量。表明卵巢中5-HT与DA含量波动与卵巢发育成熟相关，这可能也是克氏原螯虾卵巢成熟的调节机制之一。5-HT与DA是克氏原螯虾卵巢发育过程中的两种重要的胺类，它们与各种激素之间的相互作用有待于更进一步的研究证实。
