剖析影响草鱼消化酶的因素

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1材料与方法

1.1实验饲料以大豆粕、次粉、米糠等配制全植物性基础饲料(阴性对照组)，在基础饲料中添加2%磷酸氢钙(dibasiccalciumphosphate，DCP)作为阳性对照组。饲料原料购自上海农好饲料有限公司，植酸酶活力为5000U/g(Danisco公司，所用植酸酶适宜pH。

1.2实验用鱼实验用草鱼幼鱼为规格相近的当年同批鱼种，取自上海海洋大学南汇滨海养殖基地，新吉富罗非鱼购自海南宝路水产科技有限公司，两种鱼在上海海洋大学滨海养殖基地暂养1周后开始正式实验。

1.3饲养管理挑选健壮、规格整齐、平均体质量为(12.59±0.09)g的草鱼和平均体质量为(9.59±0.12)g的新吉富罗非鱼随机分入200L的塑料圆桶中，每种鱼分6个组，每组设置5个重复，每个重复20尾鱼。用上述对照饲料和实验饲料饱食投喂草鱼和罗非鱼，每天投喂2次(07:30时、17:30时)，投喂量为体重的3%～5%，随鱼体重量、天气及摄食情况加以调整。养殖周期为8周，养殖期间，水温25～30℃，NH+4-N＜0.4mg/L，溶解氧(dissolvedoxygen，DO)＞5mg/L。

1.4样品的采集与处理养殖实验结束前饥饿1d后取样，每个重复随机取3尾鱼，每3尾鱼合并成一个样本，取肝胰脏、肠(去除内容物)、胃(罗非鱼，去除内容物)分别装入1.5ml离心管中，置于－20℃保存。酶活测定时，pH7.2的磷酸盐缓冲液与所取内脏样品以9∶1［体积(ml)∶重量(g)］移入匀浆管，按2000r/min的速度在匀浆机上匀浆，4000r/min4℃离心10min，取上清，置于4℃保存备测，24h内测完。

1.5消化酶比活力的测定蛋白酶活力采用福林-酚法测定，总蛋白试剂盒(双缩脲法)购自迈瑞公司。蛋白酶比活力定义:在pH=7.2(胃蛋白酶为pH=2.5)40℃条件下，组织中每克蛋白1min水解酪素产生1μg酪氨酸定为一个蛋白酶比活力单位(U/gprot)。淀粉酶比活力采用碘-淀粉比色法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。淀粉酶比活力定义:组织中每克蛋白在pH=7.2温度37℃条件下与底物作用30min，水解10mg淀粉定义为一个淀粉酶比活力单位(U/gprot)。

1.6数据处理实验数据用平均值±标准差表示。用SPSS17.0软件进行统计，先进行单因素方差分析(one-wayanalysis，ANOVA)，影响显著者再进行Duncan’s多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2结果

2.1植酸酶对草鱼和罗非鱼淀粉酶比活力的影响表3显示，草鱼肠淀粉酶比活力各组之间无显著差异(P＞0.05)。草鱼阳性对照组肝胰脏淀粉酶比活力显著高于阴性对照组(P＜0.05)，但与1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组差异不显著(P＞0.05);肝胰脏淀粉酶比活力1000U/kg植酸酶实验组比阴性对照组、250U/kg和500U/kg植酸酶实验组分别提高57.85%、37.28%和50.22%(P＜0.05);2000U/kg与1000U/kg植酸酶实验组肝胰脏淀粉酶比活力差异不显著(P＞0.05);250U/kg和500U/kg植酸酶实验组肝胰脏淀粉酶比活力比阴性对照组略有升高，但差异不显著(P＞0.05)。罗非鱼肠淀粉酶比活力阴性对照组显著低于阳性对照组(P＜0.05);250U/kg和500U/kg植酸酶实验组比阴性对照组略有升高，但差异不显著(P＞0.05);1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组淀粉酶比活力比阴性对照组分别提高了53.37%和51.17%(P＜0.05)。肝胰脏淀粉酶比活力各组之间差异不显著(P＞0.05)。胃淀粉酶比活力，植酸酶实验组与阳性对照组差异不显著，但均显著高于阴性对照组，250U/kg、500U/kg、1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组比阴性对照组分别升高27.15%、37.22%、39.48%和26.54%(P＜0.05)。

2.2植酸酶对草鱼和罗非鱼蛋白酶比活力的影响，草鱼肠蛋白酶比活力250U/kg和500U/kg植酸酶实验组与阴性对照组差异不显著;1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组比阴性对照组分别提高了15.33%和16.69%(P＜0.05)，且与阳性对照组无显著性差异(P＞0.05)。草鱼肝胰脏蛋白酶比活力250U/kg植酸酶实验组比阴性对照组提高7.91%(P＞0.05);500U/kg、1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组比阴性对照组分别提1000U/kg植酸酶实验组比阳性对照组提高60.64%(P＜0.05)。罗非鱼肠蛋白酶比活力各实验组之间均无显著性差异(P＞0.05)。罗非鱼肝胰脏蛋白酶比活力各植酸酶添加组与阴性对照组相比均无显著性差异(P＞0.05);1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组可以达到阳性对照组水平(P＞0.05)。罗非鱼胃蛋白酶比活力250U/kg、500U/kg植酸酶实验组略高于阴性对照组(P＞0.05);1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组显著高于阴性对照组38.21%和41.12%(P＜0.05)，但与阳性对照组差异不显著(P＞0.05)，4个植酸酶实验组之间差异不显著(P＜0.05)。

3讨论

植酸是植物细胞壁的组成成分，植酸酶的添加能破解细胞壁，水解植酸，消除其对消化酶的抑制作用，促进消化酶和底物的作用(祁艳霞等2004);植酸酶作为外源酶，适量添加能够促进内源酶的分泌(黎军胜等2005);同时植酸酶添加前后磷的吸收量变化也会因鱼体内的能量代谢影响鱼类消化酶的代谢过程。酸、碱、重金属等是蛋白质立体结构的破坏体，二价金属离子如Ca2+、Mg2+、Fe2+等对消化酶具有抑制作用(吴尚忠1983)。但不同的金属离子对肝胰脏淀粉对不同部位消化酶的影响也不同(黎军胜2004)。随着植酸酶添加量的增加，原被螯合的金属离子和重金属离子被释放，且浓度越来越高，成为抑制剂或激活剂(辛碧芬等2009)。本研究发现，植酸酶对草鱼和罗非鱼的消化酶比活力的影响随着酶量和消化系统部位的变化而变化，如淀粉酶比活力在草鱼肝胰脏中和罗非鱼肠中变化显著;而蛋白酶比活力除在罗非鱼肠中变化不显著外，在罗非鱼的肝胰脏、胃以及草鱼的肠、肝胰脏变化显著，可能是植酸酶释放了被植酸络合的金属离子，这些金属离子对草鱼和罗非鱼各部位消化酶的影响不同所致。当植酸酶超过一定量后，消化酶比活力并不随着植酸酶添加量的增加而继续升高，这可能是消化酶在金属离子作为抑制剂和激活剂双重作用下表现出不同活性的结果。

3.1植酸酶对草鱼和罗非鱼淀粉酶比活力的影响本实验中，草鱼肠淀粉酶比活力各组之间无显著性差异，而马恒甲等(2011)认为当植酸酶添加量达到1000U/kg时，肠淀粉酶活力显著高于阴性对照组，这种差异可能是两者植酸酶品种或草鱼规格不同所致。本实验中，草鱼肝胰脏淀粉酶比活力1000U/kg植酸酶实验组最高，与阳性对照组的效果相近，说明植酸酶在草鱼中可部分替代磷酸氢钙，用于生产饲料中不会影响淀粉酶比活力。植酸酶添加量到达2000U/kg时，草鱼肠道和肝胰脏淀粉酶比活力与1000U/kg植酸酶实验组比无显著变化，说明草鱼的淀粉酶比活力对高水平植酸酶有一定的适应性。真骨鱼类胃中发现有微弱淀粉酶活性，很可能是因为唾液淀粉酶随食物进入胃中，刚摄入食物时，胃内容物的pH接近中性，随着唾液淀粉酶继续发挥作用，一直到胃内容物的pH变为4.5，唾液淀粉酶失活(孟庆闻等1987)。胃内低pH环境不利于淀粉酶起作用，因此，自然条件下罗非鱼等有胃鱼主要依靠肝胰腺和肠的淀粉酶对糖类起消化作用。罗非鱼饲料中添加250U/kg植酸酶，肠淀粉酶比活力显著提高，添加量达到1000U/kg时，肠淀粉酶比活力已经略超过阳性对照组，比直接添加无机磷源的效果更好，说明就淀粉酶比活力而言，在罗非鱼饲料中用植酸酶全部替代磷酸氢钙是可行的。研究认为植酸酶添加量在1000U/kg时，奥尼罗非鱼前肠淀粉酶活性最高(姚瑞清等2008)，这与本研究结果类似，但1500U/kg和2000U/kg植酸酶剂量组的前肠淀粉酶活力显著下降，这与本实验肠淀粉酶活力在2000U/kg时维持稳定的结果不一致，可能是因为消化酶在全肠中呈不均匀分布，前肠的消化酶活力并不能代表全肠(朱爱意等2010)。

3.2植酸酶对草鱼和罗非鱼蛋白酶比活力的影响本实验中，草鱼蛋白酶比活力肠＞肝胰脏。1000U/kg组为最佳添加组，其肝胰脏蛋白酶比活力显著高于阳性对照组，比直接添加无机磷源的效果更好，此结果和马恒甲等(2011)在草鱼中的研究结果一致。罗非鱼蛋白酶比活力肝胰脏＞胃＞肠，肠蛋白酶和肝胰脏蛋白酶比活力在各植酸酶实验组和阴性对照组之间没有显著差异，说明植酸酶对罗非鱼的肠蛋白酶和肝胰脏蛋白酶很敏感，并可能已作为底物被这两种蛋白酶部分分解而造成植酸酶和蛋白酶活性的削弱(付石军等2005)，抑或植酸酶经过胃时，在胃中发挥作用的同时作为底物被胃蛋白酶部分分解。胃是进行消化作用的重要场所，胃内壁具有胃腺，主要功能是分泌胃蛋白酶。本实验中罗非鱼胃蛋白酶比活力在1000U/kg和2000U/kg植酸酶实验组中得到显著提高，说明植酸酶对罗非鱼蛋白酶比活力的影响主要发生在胃且对胃蛋白酶有很强的抵抗力，没有或者很少被胃蛋白酶分解，此结果和前肠蛋白酶比活力在植酸酶1000U/kg时达到最大(姚瑞清等2008)的结果有一定差异，其原因可能与对淀粉酶的影响相似，即前肠的消化酶活力并不代表全肠。

3.3鱼类食性对植酸酶作用效果的影响食物消化时间在不同食性鱼类中长短不一，常会影响外源酶的消化作用。草鱼是典型的草食性无胃鱼类，草食性鱼类比杂食性鱼类的比肠值大，食物在其肠中的停留时间相对较长，且肠绒毛发达，吸收能力强(毕冰等2011)，因此在草鱼消化道呈碱性的情况下，植酸酶在单位时间内发挥作用小，但随着作用时间的积累，或能有效影响消化酶比活力。罗非鱼是典型的杂食性有胃鱼类，食物停留在胃内的时间较长，其胃排空时间为9h(孙晓锋等2011)，所以消化时间较长，有利于植酸酶的作用。消化酶的活性强弱与鱼的食性密切相关，草鱼的消化道中淀粉酶活性较高，罗非鱼消化道中蛋白酶活性较草鱼高。

作者：华雪铭陈瑶琴王世忠钟国防周洪琪单位：上海海洋大学上海市水产养殖工程技术研究中心