皮革APEO测定研究

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前言

皮革中烷基酚聚氧乙烯醚主要包括壬基酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚，是皮革中常用的表面活性剂。烷基酚聚氧乙烯醚(apeo)是继脂肪醇聚氧乙烯醚之后的另一大类非离子型表面活性剂，因其分子结构中同时含有亲水基团和疏水基团，具有良好的乳化、润湿、渗透性能，及起泡、洗涤、去污、抗静电等作用，广泛应用于皮革、纺织、塑料、橡胶等鞋材中。APEO中以壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)为最多，占80%以上;其次是辛基酚聚氧乙烯醚(OPEO)，占15%以上［1］;烷基酚聚氧乙烯醚及其生物降解代谢物具有较强的生态毒理效应和生物累积性，且应用于皮革中很多是通过界面吸附或胶束行为的物理过程达到预定的功能，化学结构并未受到影响，因此对环境与人类健康具有潜在的危害性。APEO生物降解缓慢，降解后产生含有较少乙氧基(EO)的APEO和烷基酚(AP)，其毒性均远高于母系化合物，其中壬基酚(NP)是一种内分泌干扰物，毒性最大，对野生生物和人类具有潜在的危害［2］。2003/371/EC法规是欧盟规定纺织品生态标签(Eco－Label)的新标准，该标准禁止了包括APEO在内的7种表面活性剂以及排放由它们组成的制剂或配方的废水，因此APEO和用它配制的印染助剂都将受到限用或禁用。鉴于APEO较大的毒性和较差的生物降解性，世界上的很多国家(如德国、丹麦、比利时、瑞士等)从20世纪80年代就开始提出对APEO禁用和限用。东北大西洋海洋环境保护公约(OSPAR公约)中提出，优先控制15类化学物质中的第12类为NPEO及其相关化合物。对于当时争议颇多的APEO虽然没有法规，但已有非正式的协议对其生产和使用加以限制。2003年6月18日欧盟颁布的2003/53/EC指令［3］，对APEO中的NPEO和NP的使用、流通及排放作出了相应的限制和规定。世界著名的检测公司如天祥、SGS均限定APEO含量低于100mg/kg。2006版的Intertek生态产品(皮革和纺织品)认证也新增APEO的评估项目，限量值为50mg/kg。目前我国还没有用于检测皮革中烷基酚聚氧乙烯醚的方法标准，纺织品中的检测方法是以液相色谱－质谱为主，但由于液质联用仪价格昂贵，行业内大多数实验室并不具备该仪器。本文研究的主要目的就是采用液相色谱－二极管阵列检测器(HPLC－DAD)定量方法，测定皮革中残留的OPEO、NPEO，建立一套准确测定皮革中APEO残留量的快速、简便方法。

1试验部分

1．1研究的理论依据

由于烷基酚聚氧乙烯醚在聚合度稍高(大于4)的情况下很难被汽化，直接用气相色谱法－质谱法进行测定十分困难，烷基酚聚氧乙烯醚易溶于甲醇，在波长225nm和276nm处有最大吸收［4］。因此可以用液相色谱仪配二极管阵列检测器(HPLC－DAD)，对APEO进行分离并进行定量测定。

1．2试剂和材料

甲醇(色谱纯);乙腈(色谱纯);NPEO标准品(德国汉高公司，纯度≥99%，n=9);OPEO标准品(德国汉高公司，纯度≥99%，n=10);NPEO和OPEO标准储备液用甲醇配制质量浓度0．5g/L左右的APEO工作液储备液，使用时用甲醇配制成需要的浓度。

1．3仪器

液相色谱仪(HPLC－DAD)(Agi-lent1290infinity);分析天平(精确到0.0001g);索式提取器;超声波提取仪(可保持温度30～60℃);旋转蒸发仪;氮吹设备;常规玻璃仪器;有机相过滤膜(0．45μm和0．22μm);一次性针孔过滤器(2mL和20mL)。

1．4超声波或索式提取和操作的准备

称取剪碎至5mm×5mm以下大小的皮革1．0000g左右，用25mL甲醇在超声波萃取器(或索式提取器)中在一定温度条件下进行萃(提)取，一定时间后，过滤萃取液到适当烧瓶中，再用15mL甲醇洗涤残渣，合并过滤至烧瓶中，经过净化处理后，用旋转蒸发仪浓缩至约近干，用氮气吹干。加入2mL甲醇定溶，用于HPLC－DAD分析定量。

1．5液相色谱的使用条件研究

1．5．1流动相的选择条件1

HPLC检测条件:固定相:反相C18流动相:70%甲醇/30%水流速:1．0mL/min柱温:35℃进样量:10μLHPLC－DAD定量分析波长:225nm或276nm。条件2HPLC检测条件:固定相:反相C18流动相:甲醇∶水∶乙腈=81∶13∶6流速:1．0mL/min柱温:35℃进样量:10μLHPLC－DAD定量分析波长:225nm或276nm。对含有NPEO和OPEO的混合标准品，按照条件1和条件2进行操作。在条件1的操作中，流出时间40min内，液相色谱图中没有出现烷基酚聚氧乙烯醚的色谱峰;在条件2的操作中，在流出时间4．6min和6．2min时间左右，得到了OPEO和NPEO的色谱峰(见图1)，峰形完整，分离彻底，干扰少，满足对烷基酚聚氧乙烯醚的检测需要，因此流动相选择甲醇∶水∶乙腈=81∶13∶6。

1．5．2吸收波长的选择

由实际操作发现，烷基酚聚氧乙烯醚在波长225nm处的吸收大于276nm处的，故选择225nm波长为本试验的最佳条件(具体图谱见图1)。1．5．3液相色谱的使用条件检测器:DAD固定相:反相C18;流动相:甲醇∶水∶乙腈=81∶13∶6;流速:1．0mL/min;柱温:35℃;进样量:10μL;定量分析波长:DAD225nm。

1．6萃取方法对试样定量结果影响的研究

由于皮革经过萃取后会含有很多干扰测定的成分，如不采取净化技术进行处理，可能会严重干扰测定结果，甚至不能得出检测结果，因此对样品萃取液进行净化处理是十分必要的。

(1)采用固相萃取柱:OasisHLB、60mg、mL。使用前依次用2mL甲醇、4mL水活化。操作方法:将样品提取液过滤转移到烧瓶中，用适量甲醇洗涤样品，并过滤转移合并萃取液，用旋转蒸发仪蒸发至干，再加入10mL甲醇溶解萃取物，全部转移到固相萃取柱中，控制流速为1～2mL/min。待甲醇不再流出后，弃去甲醇，用5、10mL甲醇－二氯甲烷洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，准确加入2mL甲醇溶解定容，用0．22μm膜过滤至小样品瓶中，用于液相色谱定量使用。净化效果的判定:用配好的NPEO标准溶液经过同样的处理，通过回收率验证净化效果。结果见表1，相对应的色谱峰见图1。从表1中的结果可以看出:用净化柱处理烷基酚聚氧乙烯醚，无论洗脱剂用量是5mL还是10mL，其回收率均在33%～51%之间，效果很差，不能满足检测需要。

(2)采用尼龙膜过滤方式使用的尼龙过滤膜为孔径0.45μm和0．22μm。将标准溶液加入到萃取液中，经过60min萃取后，用20mL针管经过0．45μm的膜过滤到平底烧瓶中，经过旋转蒸发后，加入2mL甲醇定容，再用2mL的针管经过0．22μm的尼龙膜过滤，用于液相色谱的检测。在过滤的过程中，尽量使用同一个过滤膜过滤完成，以避免溶液损失，对于APEO含量较高的样品，采用10mL甲醇定容的方式进行，以保证所检浓度在仪器的线性检测范围内，对于颜色较重或含量较高的样品，一次过滤后如不能达到目的，可多次过滤。吸取一定量的标准溶液，经过上述程序处理后，得到结果见表2。由表2可以看出:经过2～3次的过滤膜过滤，完全可以达到净化的目的，回收率在93%～98%之间，可以满足检测要求。

1．7提取方式的研究

1．7．1索式提取方式

用150mL甲醇，在索式抽提仪中进行抽提。抽提时间对样品测定结果的影响，其结果见表3。由表3可以看出:索式抽提5～6h，峰面积基本不再增加，可以推定提出了全部的烷基酚聚氧乙烯醚。但此方法使用溶剂量大，抽提时间长，污染较为严重。

1．7．2．1萃取时间对定量测定的影响(50℃)

由表4可以看出:在50℃时，萃取总时间为60min时，萃取结果和索式萃取结果基本相近，但所用时间短，溶剂用量少，因此本研究采用萃取时间为60min的萃取方法。

1．7．2．2萃取温度的确定

由于采用甲醇作为萃取溶剂，可由下列因素确定萃取温度:皮革的使用温度一般不超过50℃，可考虑在实际穿着时的最极限温度不超过50℃;甲醇的沸点为63℃，考虑到甲醇在萃取时的可挥发性，以确定萃取温度50℃为宜。经过实际的萃取操作后，经过50℃条件下萃取60min，其萃取结果和索式提取的结果十分相近。因此本研究确定萃取温度为50℃。

1．7．2．3萃取溶剂选择

分别选取叔丁基甲醚、二氯甲烷、正己烷、甲醇作为溶剂，对皮革样品进行超声波萃取，结果见表5。由表5可以看出:用甲醇萃取的结果最大，效果最好;正己烷的效果最差。本试验采用甲醇作为提取溶剂。

1．8定量方法研究

1．8．1混合标准样品标准曲线的建立

用辛基酚聚氧乙烯醚(OPEO)和壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)混合，配制成表6中的浓度，结果见表6。用浓度为横坐标，保留面积为纵坐标，形成的坐标图见图2和图3。对于NPEO，线性方程为Y=63.45x+473．7，R值为0．9985对于OPEO，线性方程为Y=16.87x+291．2，R值为0．9980由图2和图3可以看出，在浓度为20～250mg/kg之间峰面积和浓度，呈良好的线性范围。

1．8．2皮革样品的检测和计算

根据样品中烷基酚聚氧乙烯醚的含量，选择浓度相近的标准工作液。对标准工作液和样液等体积穿插进样。计算公式为:按式(1)计算试样中烷基酚聚氧乙烯醚的含量

1．8．3黑色牛皮萃取液的色谱图和标准品色谱图的比较

称取1．0022g左右样品，经过浓缩和净化处理后，用于液相色谱仪的检测。标准品的色谱图见图4;黑色牛皮萃取液的色谱图见图5。由图4和图5中可以看出:标准样品OPEO的保留时间4．472minNPEO的保留时间6．038min样品中OPEO的保留时间4．458min，色谱峰面积7032NPEO的保留时间5.960min，色谱峰面积314085所测物质与标准品的保留时间位置十分吻合，结合气质联用仪的定性确证，可以断定是OPEO和NPEO。经过3次测定并计算，该牛皮样品中NPEO含量为977、1004和1037mg/kg。平均值为1006mg/kg，平均偏差在2．88%、2.0%和3．08%，符合检测需要。由图5可以看出:该方法对皮革样品中OPEO和NPEO的分离彻底，样品中其他组分几乎对检测无干扰。

1．9检出限和回收率的测定

1．9．1检出限的测定

在本方法确定的试验条件下，采用标准溶液对应的信噪比的3倍作为本方法的检出限，相对应的OPEO和NPEO检出限为3．4和3.7mg/kg。

1．9．2回收率的测定

方法:称取1．0g左右已知NPEO含量的待测样品(牛皮样品)，加入校准溶液，利用本方法处理后，测得其含量，计算回收率。结果见表7。

由表7可以看出:NPEO的回收率在86%～94%之间，相对偏差为2.95%;OPEO的回收率在102%～110%之间，相对偏差为3．11%。10对皮革和其他样品的检测结果基酚聚氧乙烯醚的含量确实很高，大多数样品中均含有NPEO。如果按照欧盟相关标准限量100mg/kg来看，大多数产品处于严重不合格状态，因此，烷基酚聚氧乙烯醚的限量和检测问题，应引起相关部门的高度重视。

2结论

(1)高效液相色谱配二极管阵列检测器完全可以满足检测要求。(2)皮革材料中烷基酚聚氧乙烯醚的最佳萃取时间为60min，最佳萃取溶剂是甲醇，用超声波萃取方式萃取可满足检测需要，节省时间和溶剂。(3)流动相采用甲醇∶水∶乙腈=81∶13∶6可以满足检测需要。(4)该方法的检测线性范围、检出限和回收率均能满足试验要求。(5)通过检测，我国相关产品中APEO含量非常高。问题十分严重，应引起相关部门的高度重视。