发酵法制备葡聚糖菌种培养

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右旋糖酐(Dextran)又名葡聚糖，是若干葡萄糖脱水形成的聚合物，它作为血容量补充药已广泛用于医疗临床，不同分子量的右旋糖酐具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等活性[1]。右旋糖酐的制备方法有发酵法和酶法。右旋糖酐的产生菌株一般为肠膜明串珠菌[2]。代表性菌株是美国NRRL研究所分离的肠膜明串珠菌NRRLB-512F，该菌株已经被工业化应用。国内右旋糖酐的制备多使用肠膜明串珠菌[3-5]。本文选用购于中国工业微生物菌种保藏中心的肠膜明串珠菌20074，以培养液浊度和pH值作为考察指标，对培养基进行优化。

1实验部分

1.1主要仪器与材料

UV-4802H双光束紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司。肠膜明串珠菌：中国工业微生物菌种保藏中心，CICC编号为20074。基础培养基组成：蔗糖13%(13g/100mL，下同)、蛋白胨0.2%、磷酸氢二钠0.14%、磷酸二氢钾0.03%。

1.2实验方法

1.2.1培养基的配制液体培养基：按照培养基组成称量药品，加水加热煮沸溶解，冷却到室温之后定容，调节pH到指定值，将培养基分装到锥形瓶和试管中，塞好棉塞，用牛皮纸包扎，0.1MPa压力下灭菌20min，然后自然冷却。固体培养基：在灭菌之前的液体培养基中加入1.5%~2%的琼脂，煮沸溶解，分装之后，塞好棉塞，用牛皮纸包扎，0.1MPa压力下灭菌20min，然后自然冷却。

1.2.2菌种活化及保存将安锫管在75%的酒精中浸泡30min，在酒精灯上方烘烤然后滴少许无菌水在瓶口，用镊子轻轻从瓶口裂痕处敲开，加入0.4mL无菌水，摇动至呈乳浊液，用接种环接种于斜面和平板培养基上，在指定温度下恒温活化3d。活化后选择平板或者斜面上面生长较好的菌落，接种于液体培养基中传代培养1~2d，即可使用。以上均为无菌操作。菌种保存：活化后液体培养基中培养2~3d的培养液分别接种于斜面上，指定温度下培养48h，4℃冰箱中保存。菌种保存在斜面上，每1个月转接1次。首先由斜面转接到液体培养基中，培养10h，接种到斜面上，培养48h，放入冰箱，4℃保存。

1.2.3基础培养基组分含量优化分别改变培养基中的蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4和KH2PO44种基础组分的含量，接种量5%，在28℃、100r/min时恒温摇床培养24h，以起始培养基为空白在λ=450nm时测定浊度，同时测定培养液pH值。各个组分含量的变化如表1所示。

1.2.4培养基中无机氮源的选择在培养基中加入不同种类和含量的无机氮源，培养条件同1.2.3，以起始培养基为空白在λ=450nm时测定浊度，同时测定培养液pH值。无机氮源的种类和含量的变化见表2。

1.2.5培养基中添加剂的选择在培养基中加入不同的添加剂，培养条件同1.2.3，以起始培养基为空白在λ=450nm时测定浊度，同时测定培养液pH值。

1.2.6培养基中金属离子的选择在培养基中加入不同的金属离子，选用L16(45)正交表，做正交实验，培养条件同1.2.3，以起始培养基为空白在λ=450nm时测定浊度，考察金属离子种类和含量对菌生长的影响。各因素水平见表3。

1.2.7生长曲线的测定将斜面保存的菌接种到液体培养基中，培养10h之后得种子培养液。接种5%的种子培养液到新的培养基中，将接种后的液体培养基分装于试管中，每支试管5mL。在28℃、100r/min下恒温摇床培养，每2h取样1支，以起始培养基为空白在λ=450nm时测定吸光度，同时测定培养液pH值。

2结果与讨论

2.1基础培养基组成对菌体生长的影响

2.1.1蔗糖含量对菌体生长的影响蔗糖在右旋糖酐的制备过程中，是碳源也是底物。蔗糖作为碳源在肠膜明串珠菌20074的作用下产生右旋糖酐蔗糖酶，右旋糖酐蔗糖酶将作为底物的蔗糖转化成右旋糖酐和果糖。蔗糖含量改变对培养液浊度和pH值影响见图1。蔗糖含量为10%时，培养液中菌含量达到最大，pH值下降到最低，说明此条件下中菌体生长较好。蔗糖浓度太低可能是底物浓度不足，太高可能会抑制肠膜明串珠菌20074的生长，所以选择蔗糖含量为10%。

2.1.2蛋白胨含量对菌体生长的影响蛋白胨由蛋白质水解而制得，在细菌的培养中为菌体的生长提供主要的氮源，是细菌培养基应加入的营养物质。蛋白胨含量改变对培养液浊度和pH值影响如图2所示。当蛋白胨含量增加到0.20%之后，培养液浊度和pH值随蛋白胨含量的增加变化不大且蛋白胨的增加会增加培养成本。因此，选择培养基蛋白胨含量为0.20%。

2.1.3Na2HPO4、KH2PO4含量对菌体生长的影响Na2HPO4为菌的生长提供磷和钠，这2种元素对菌的生长是必需的[6]，同时，Na2HPO4还能对培养液的pH值起到缓冲作用。培养基中Na2HPO4的浓度对培养液浊度和pH值的影响见图3。虽然含量的增加使培养液浊度增加，但当浓度大于0.20%后培养液浊度下降，说明对菌体的生长产生不利的影响，所以选择0.20%。K+也是菌体生长必需的元素之一，培养基中KH2PO4的浓度对培养液浊度和pH值的影响见图4。在本实验条件范围内，KH2PO4含量为0.03%时，培养液浊度出现最大值，而且pH值增加速度开始变大，所以选择基础培养基中KH2PO4含量0.03%较为合适。

2.2无机氮源含量对菌体生长的影响

菌的生长所需要的氮源包括有机氮源和无机氮源，常用的无机氮源有NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3等。在培养基中加入无机氮源对菌体生长的影响见图5、图6和图7。NH4Cl的加入使培养液的菌含量有所下降，所以不利于菌体的生长，不应作为培养基的组分加入，pH的下降可能是因为NH4Cl的加入造成的。与NH4Cl相同，培养基中加入实验所选浓度的(NH4)2SO4同样会使菌含量下降，而且pH值略有增加，对菌体的生长产生不利影响。尽管一定浓度的NaNO3加入到培养基中使菌含量增加，但是与未加入时相比变化不大，说明NaNO3对菌的生长影响不大。

2.3添加剂对菌体生长的影响

菌体生长除了需要碳源、氮源以及一些无机盐之外，一定量的添加剂可以为菌体生长提供生长因子，强化菌体的生长。常用的添加剂有番茄汁、玉米汁、牛肉浸膏、酵母浸膏等。实验选用牛肉浸膏和酵母浸膏作为添加剂，培养结果见图8、图9。当加入一定量的牛肉浸膏到培养基中，在相同的培养条件下，培养液的浊度增加不大，培养液的pH值变化也不大。所以，牛肉浸膏对肠膜明串珠菌生长的作用不大。酵母浸膏富含维生素、氨基酸和一些其他营养成分，可为菌体的生长提供所需的生长因子。酵母浸膏含量对菌体生长的影响的实验结果见图9，培养液的浊度OD值随着酵母浸膏含量的增加而增加，培养液的pH值却明显下降。可见，酵母浸膏的加入可明显促进肠膜明串珠菌20074的生长。培养基中酵母浸膏含量大于0.5%时浊度增加速度和pH值下降速度明显减慢，所以，选择培养基中酵母浸膏的加入量为0.5%。

2.4金属离子对菌体生长的影响

金属离子对肠膜明串珠菌20074生长影响的正交实验按L16(45)安排进行，结果见表4。培养基其他组成为：蔗糖10%、蛋白胨0.2%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.03%、酵母浸膏0.5%。从实验结果可知，Mn2+离子对菌体生长的影响较大，在实验所选的范围内，其他金属离子对菌体生长的影响不大。

2.5菌体生长曲线

在选择的培养条件下，以培养液的OD值为指标，测定了肠膜明串珠菌20074的生长曲线，结果见图10。0~8h内随培养时间的延长，培养液浊度变化不大，即菌含量变化不大，为肠膜明串珠菌20074生长的延迟期；8~24h内菌含量随培养时间迅速增加，是膜明串珠菌20074生长的对数期；24h之后，菌含量基本稳定，菌生长达到稳定期；30h开始，菌含量略有下降，菌的生长达到衰亡期。在菌体生长过程中，同时生成一系列生理酸性物质，引起pH值下降。

3结论

对基础培养基的各组分含量进行优化，得到最优组成为：蔗糖10%、蛋白胨0.2%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.03%。无机氮源NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3不能明显加快肠膜明串珠菌20074的生长。添加剂酵母浸膏可明显促进肠膜明串珠菌20074的生长，加入量为0.5%。实验所选的范围内，金属离子中Mn2+对菌体生长的影响较大。肠膜明串珠菌20074的生长曲线表明，0~8h是生长延迟期，8~24h为对数期，24~30h为稳定期，30h之后为衰亡期。