MeJA处理对采后葡萄品质的影响

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葡萄为我国主要的经济类水果之一，加工和消费需求量极大，商业价值很高。但葡萄作为典型的非跃变型果实，其含水量高、组织娇嫩且生理代谢旺盛，采后衰老进程很快，果实极易自果穗上脱落形成落粒，这极大降低了葡萄果实的商品性[1]。葡萄采后落粒作为一种典型的植物器官脱落现象，其与葡萄离区(果实脱落区域及邻近部分)组织中生理代谢失调以及细胞衰老进程密切相关[2]。大量研究表明，采后葡萄果实在低温贮藏期间，随着贮藏时间的延长，其离区组织中脂氧合酶活性逐渐上升，显示细胞膜脂逐渐出现过氧化症状，细胞物化结构发生明显改变，从而最终导致果实自果梗分离[3]。因此，延缓葡萄离区细胞膜脂过氧化进程是控制葡萄采后落粒症状发展的有效措施。茉莉酸甲酯(meja)为植物中的天然精油成分，可在植物细胞内发挥信号传导作用来调控植物生长发育、后熟衰老、抗逆性和次生代谢产物合成等一系列生理生化反应[4]。大量研究表明，外源MeJA处理可有效提高枇杷[5]、番木瓜[6]和桃[7]等果实中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)或过氧化物酶(POD)等活性氧代谢酶活性，清除果实中过量的活性氧自由基，减慢细胞膜脂过氧化进程和透性的上升，从而控制了果实采后衰老或冷害症状的发展。我们先期研究也证实，浓度为10μmol/LMeJA熏蒸处理可显著诱导采后葡萄果实抗病相关酶活性的上升，降低贮藏期间扩展青霉导致青霉病的发病率[8]，但现阶段有关MeJA处理对采后葡萄离区细胞膜脂过氧化及果实落粒的影响却尚未见报道。因此，本研究以“巨峰”葡萄为试材，首先分析了外源10μmol/LMeJA熏蒸处理对冷藏期间葡萄落粒的影响，再从离区细胞膜脂过氧化的角度探讨相关机理，以期为MeJA处理在葡萄保鲜中的应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

本研究以棚栽“巨峰”葡萄为试材，于2011年7月26日采自重庆市万州区新田镇葡萄种植基地，于采收后2h内运回实验室。除去尚有机械损伤、病虫害及未成熟的果实，挑选大小基本一致、无明显落粒现象和转色均匀的完熟果穗，于实验台上摊开并风凉。采摘当天用手持硬度计测定的葡萄果实硬度为(7.83±0.28)N，可溶性固形物和可滴定酸含量经测定分别为(9.73±0.09)%和(1.36±0.10)%。

1.2试剂与仪器

α-萘胺、氮蓝四唑、盐酸羟胺：国药集团化学试剂有限公司；亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸：重庆怡景化工有限公司；邻菲罗啉、核黄素、甲硫氨酸：西陇化工有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、抗坏血酸、色谱纯甲醇：重庆西南化学试剂公司；MeJA(纯度大于95%)：美国Sigma公司；其余常用试剂如盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸、醋酸钠、丙酮、乙醇等：万州医药试剂公司，纯度为分析纯。WYT-4型手持折光仪：泉州光学仪器厂；PHS-3C型pH计：杭州雷磁分析仪器厂；OKD-656精密台式电导率仪：深圳欧克仪表科技有限公司；UV-1600型分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；GL-20G-H型冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；GHP-9080型隔水式电热恒温培养箱：上海申贤恒温设备厂；YP3001N型电子天平：上海精密仪器仪表有限公司；超低温冰箱：海尔公司；SP-6800A型气相色谱仪：山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司。

1.3处理方法

在前期实验中，我们将葡萄果穗分别放在密闭室内在20℃下以0(对照)、1、10、100、1000μmol/LMeJA熏蒸处理6h。处理结束后，将果穗通风1h后用聚乙烯塑料袋分装，于(1±1)℃下贮藏28d后测定果实落粒率、腐烂率以及其他品质参数。结果发现，10μmol/LMeJA处理对葡萄果实采后腐烂的抑制效果最佳，同时最为明显的维持了果实贮藏品质[8]，故以此作为MeJA处理的条件。本实验将挑选出的葡萄果穗随机分为2组，处理组于密闭室内在20℃下用10μmol/LMeJA熏蒸处理6h，对照组在20℃下密闭放置6h，处理结束后，将果实通风1h后分装，在(1±1)℃、相对湿度(90~95)%下贮藏28d。分别在处理前(0d)和处理后贮藏期间每隔7d取果实鲜样测定落粒率、腐烂率、褐变指数以及其他品质参数，并同时用刀片切取果穗离区组织(浆果与果蒂接合部组织4～5mm厚的位置)来测定脂肪酸含量和电导率；此外，再对离区组织进行取样并液氮中速冻，随后在-60℃的超低温冰箱中保存，用于其余指标的测定。每个处理约6kg葡萄果穗，分装60袋，整个实验重复3次。

1.4测定方法

1.4.1落粒率

葡萄果实自果穗自然脱落即记为落粒。落粒率(%)=(落粒数/总粒数)×100

1.4.2腐烂率

葡萄果实表面出现霉菌性病斑即记为烂果。腐烂率(%)=(烂果数/总果数)×100

1.4.3果实可溶性固型物(TSS)和可滴定酸(TA)含量以及pH值测定

用WYT-4型手持折光仪测定果实可溶形固型物含量；采用标准氢氧化钠滴定法测定可滴定酸，结果以苹果酸百分含量表示；用pH计(PHS-25B)测定果汁pH值。

1.4.4离区细胞膜透性和丙二醛(MDA)含量的测定

离区组织细胞膜完整性以相对电导率作为评价标准，以煮沸前后的电导率比值表示相对电导率。MDA含量参照TBA比色法进行测定[9]，结果以nmol/gFW表示。

1.4.5离区活性氧代谢酶活性的测定

随机称取10g果穗离区冻样，用50mL内含2mmol/LEDTA和1g/LPVPP的200mmol/LPBS磷酸缓冲液(pH7.0)进行冰浴匀浆，10000×g冷冻离心20min(2℃)后取上清液用于测定活性氧代谢酶(SOD、CAT、APX和POD)活性和蛋白质含量。SOD活性参考Beauchamp等[10]的方法进行测定，将反应液1h内抑制NBT光还原50%为1个酶活力单位；CAT活性参考Cakmak等[11]的方法进行测定，将酶促反应液在240nm处1min降低0.001吸光值定义为1个酶活性单位；APX活性参照Nakano等[12]的方法进行测定，将酶促反应液在290nm处1min降低0.001吸光值定义为1个酶活性单位；参考Kochba等[13]的愈创木酚法测定POD活性，将酶促反应液在460nm处1min增加0.01吸光值定义为1个酶活性单位。以考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质含量[14]。

1.4.6离区超氧阴离子(O2-•)和羟基自由基生成量(•OH)测定

随机称取5g果穗离区冻样，用20mL冷丙酮冰浴匀浆，经10000×g冷冻离心20min(2℃)后取上清液，沉淀另用10mL冷丙酮振荡溶解并冷冻离心后取上清液，合并2次的上清液并定容至50mL备用。超氧阴离子和羟基自由基生成量的测定分别参考NBT光还原法[15]和脱氧核糖法进行[16]，结果均以nmol/gFW•min表示。

1.4.7离区细胞脂肪酸含量测定

取4g果穗离区鲜样用10mL提取液[氯仿:甲醇:0.1mol/LHCl(200:100:1)]匀浆并离心，取上清液旋转蒸发后用色谱纯甲醇溶解。随后采用C18Sep-Pak(购自Supelco公司，预先用甲醇活化)固相萃取小柱以内含3%甲酸的色谱纯甲醇溶液进行分离洗脱操作将其中色素吸附于固相中，洗脱液再用色谱纯甲醇定容至25mL用于测定。脂肪酸组成的测定参照Valero-Garrido等[17]的气相色谱法进行，使用配备FID检测器的SP-6800A型气相色谱仪进行测定，进样口温度、柱温和检测器温度分别为180、195、165℃，载气为氮气。采用脂肪酸甲酯流出的保留时间定性，各脂肪酸甲酯按其碳原子数增加的次序依次流出色谱柱，若碳原子数相同，则按不饱和程度增加的次序流出。以外标法测定相关物质的含量，结果均以μg/kgFW表示。

1.5数据分析

以上各测定指标除腐烂率、落粒率、褐变指数和硬度重复10次外，其余指标均重复3次。运用SPSS18.0软件进行数据处理分析，用Tukey多重比较方法进行差异显著性检验，5%为显著水平。

2结果与分析

2.1MeJA处理对葡萄果实采后落粒、腐烂及品质的影响

如表1所示，葡萄果实在1℃贮藏期间，其落粒率、腐烂率和褐变指数均在贮藏前14d呈缓慢上升趋势，而在贮藏14d后，落粒率、腐烂率和褐变指数急剧上升，至贮藏28d后，对照果实中落粒率、腐烂率和果心褐变指数分别达到54.43%、45.76%和15.32%；同时，葡萄果实在冷藏期间，其果肉TSS和TA含量逐渐下降，pH值逐渐升高，贮藏结束时，对照果实中TSS和TA含量较贮藏前下降了21.5%和13.6%，而pH值上升了15.8%。这些数据显示，冷藏28d后葡萄果实食用和感官品质明显下降，基本失去商品性。10μmol/LMeJA处理显著(p<0.05)抑制了葡萄果实在冷藏期间落粒率、腐烂率和褐变指数的上升，并延缓了果肉TA含量的下降和pH值的上升；1℃贮藏28d后，经MeJA处理的葡萄果实中落粒率、腐烂率和褐变指数较对照果实下降了78.2%、70.1%和50.6%，TA含量和pH值较对照果实高出11.2%和8.6%。因此，10μmol/LMeJA处理可有效减慢葡萄果实采后贮藏期间品质劣变速度，改善果实食用品质。

2.2MeJA处理对葡萄果穗离区相对电导率和MDA含量的影响

如图1所示，在1℃贮藏期间，对照葡萄果穗离区细胞中相对电导率和MDA含量均呈急剧上升趋势，显示离区细胞逐渐出现膜脂过氧化和衰老症状。10μmol/LMeJA处理显著(p<0.05)抑制了贮藏期间离区细胞膜相对电导率和MDA含量的上升，从而有效控制了组织衰老症状的发展。

2.3MeJA处理对葡萄果穗离区组织中活性氧代谢酶和自由基生成量的影响

我们测定了贮藏期间葡萄果穗离区组织中活性氧代谢酶SOD、CAT、APX和POD活性以及主要的2种活性氧自由基超氧阴离子和羟基自由基的生成量，以分析离区细胞中活性氧代谢水平。如表2所示，在1℃贮藏期间，对照葡萄果穗离区组织中活性氧代谢酶SOD、CAT和APX活性在贮藏时间前14d缓慢上升，随后呈现急剧下降趋势，POD活性则随贮藏时间的延长而缓慢下降；同时，对照葡萄果穗离区组织中超氧阴离子和羟基自由基生成量在贮藏期间逐渐增加，特别是贮藏14d后，其增加速度明显加快。这些数据显示，离区细胞中活性氧代谢在贮藏后期逐渐失调，从而导致活性氧自由基的大量积累。10μmol/LMeJA处理显著(p<0.05)诱导了葡萄果穗离区组织中SOD、CAT和APX活性在贮藏前期的上升，而在贮藏14d后仍延缓了SOD、CAT和APX活性的下降；同时，MeJA处理有效抑制了离区POD活性的下降。与此相对应，经10μmol/LMeJA处理的果穗离区组织中超氧阴离子和羟基自由基生成量在整个贮藏期间均显著(p<0.05)低于对照水平。

2.4MeJA处理对葡萄果穗离区细胞膜脂肪酸组成的影响

为分析葡萄果穗离区细胞膜中脂肪酸的组成，我们测定了离区中不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸以及饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸含量。如表3所示，对照葡萄果穗离区中不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸含量在贮藏期间逐渐下降，但饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸含量却缓慢上升。10μmol/LMeJA处理显著(p<0.05)抑制了亚油酸和亚麻酸含量的降低，同时延缓了棕榈酸和硬脂酸含量的上升，从而维持了细胞膜脂肪酸不饱和度，延缓了细胞膜过氧化症状的发展。

3讨论

在本研究中，我们发现10μmol/LMeJA的熏蒸处理可以显著降低葡萄果实在采后贮藏期间腐烂率、落粒率和褐变指数，维持果实TSS和TA含量以及pH值，从而维持了果实食品品质。这验证了我们有关MeJA熏蒸处理可有效提高采后葡萄果实抗病性的结论[8]，同时也与我们前期有关10μmol/LMeJA熏蒸处理可有效抑制浆果类果实如杨梅[18]和草莓[19]采后腐烂发生和品质下降的结论相一致。这表示外源MeJA处理在葡萄果实贮运保鲜中具有较好的应用前景。

植物细胞中活性氧代谢水平与细胞衰老和死亡进程密切相关：正常植物细胞中活性氧代谢处于动态平衡状态，但高盐、高温、缺水和病原菌侵染等逆境胁迫会破坏植物体活性氧代谢的平衡，使其细胞内活性氧自由基过度生成，而过量自由基会攻击细胞膜，导致膜脂逐渐过氧化和硬化，细胞膜流动性下降，最终导致细胞结构的崩溃。活性氧代谢酶SOD、CAT、APX和POD是植物中主要的酶促活性氧清除系统，这些活性氧代谢酶协同作用可清除植物组织中过量的活性氧自由基从而延缓膜脂过氧化进程[20]。在本实验中，我们发现葡萄果穗在1℃贮藏期间，其离区组织中活性氧代谢酶活性逐渐下降，而活性氧自由基生成量却逐渐上升，离区细胞膜也逐渐出现脂肪酸饱和度上升、相对电导率和MDA含量增加等过氧化症状，同时伴随着葡萄果实落粒率的显著上升。这说明在冷藏期间，葡萄果穗离区组织中活性氧代谢酶活性的下降造成了自由基的过度积累，从而导致离区细胞膜脂过氧化和果实落粒现象的发生。因此，活性氧代谢的失调导致的离区细胞衰老是采后葡萄果实落粒率增加的重要因素。

MeJA为茉莉酸(JA)的衍生物，具有较强挥发性且不易被离子化，可高效透过植物细胞膜发挥信号分子作用来诱导植物抗逆性反应[4]。大量研究证实，外源MeJA处理可有效提高贮藏期间枇杷[5]和桃[7]果实中SOD、CAT、APX和POD活性的上升，从而有效抑制这些果实贮藏期间活性氧自由基的积累，抑制相对电导率或MDA含量的上升。我们先期研究也发现，10μmol/LMeJA也可明显提升杨梅果实中抗氧化物质的合成，从而有效延缓果实中超氧阴离子和羟基自由基生成量的上升[18]。在本实验中，我们同样发现10μmol/LMeJA可显著诱导在1℃贮藏期间葡萄离区组织中SOD、CAT、APX和POD活性的上升并有效抑制超氧阴离子和羟基自由基的积累；同时，经MeJA处理的果穗离区细胞膜中不饱和脂肪酸含量明显高于对照水平，而饱和脂肪酸和MDA含量以及相对电导率则显著低于对照水平。这些结果说明，10μmol/LMeJA处理可有效诱导贮藏期间果穗离区细胞中活性氧代谢酶活性的上升，维持活性氧代谢的平衡，从而有效抑制了自由基对离区膜脂的攻击，提高了细胞膜不饱和度和流动性，并延缓了贮藏期间离区细胞的衰老进程，最终显著降低了采后葡萄果实落粒率，改善果实品质。