苜蓿酯酶提取分离与性质测定

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本文作者：王亚飞1张金艳2作者单位：1.黑龙江八一农垦大学文理学院2.黑龙江八一农垦大学教务处

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美誉[1]，它是世界上栽培最早、分布面积最广的一种优质豆科牧草。苜蓿中富含蛋白质、维生素、无机盐及促生长因子，其鲜草中粗蛋白质含量为4.5%~5.9%，干草中蛋白质含量约为15%~25%，比玉米高1~1.5倍[2]。近年，由于食用农药残留超标的蔬菜而引起食物中毒的事件时有发生，为了阻止有毒蔬菜进入市场，在蔬菜上市前进行农药残留快速检测是比较可行的办法。目前，快速检测农药残留用植物酯酶都是以粮食作物如小麦[3]、大豆[4]、荞麦、豌豆、玉米[5]等为酶源，检测成本虽然比动物酶源低，但毕竟需要消耗粮食。本文试验从价格更加低廉的苜蓿中提取植物酯酶，进行分离、纯化，并系统地对该酯酶的动力学特性及农药检测效果进行研究，为寻求植物酯酶新酶源提供依据。

1仪器与试剂

1.1仪器

UV-2802PCS型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；高速冷冻离心机：法国JOUAN；电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-(S)6数显恒温水浴锅：金坛市友联仪器研究所。

1.2试剂

硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢钠等：国产分析纯；2,6-二氯靛酚：德国。

2实验材料与方法

2.1实验材料

粗酶的提取：称取100g苜蓿嫩叶，用研钵研成匀浆，按料液比(w/v)1:10加入pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，移入锥形瓶中震荡10min，4层纱布过滤，滤液用4000~6000r/min的速度低温离心15min，取上清液，将粗酶液保存在4℃冰箱中备用。分级纯化：在不断搅拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸铵(0.3饱和度)，在1h内加完后置于4℃冰箱中过夜。次日将上清液用虹吸管吸出，下面浑浊液用4000r/min的速度低温离心15min，弃沉淀合并上清液。在不断搅拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸铵(0.6饱和度)，在1h内加完后置于4℃冰箱中过夜。次日，将上清液用虹吸管吸出，沉淀用5000r/min的速度低温离心15min，弃上清液，保留沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，装于透析袋(分子量大于10000u)中，4℃下置于pH7.0NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中透析24h，中间换4次缓冲溶液，直至无SO42-析出为止(用氯化钡检验)。将沉淀溶于1LpH7.0NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液中。

2.2试验方法

不同农药最低检测限(LDC)的确定：根据所用UV-2802PCS型紫外可见分光光度计的误差范围，以可以检测到的最小吸光度对应的农药浓度为初定检测限，在此浓度下与空白液进行t检验(n=6)，用SPSS数据处理系统处理数据，从而确定LDC。结果见表1。

3结果与分析

3.1最大吸收波长的测定及反应进程曲线

取3.5mL酶液于锥形瓶中，在40℃水浴中恒温10min，加入0.5mL显色剂，在40℃水浴中继续恒温20min，在550~640nm范围内改变波长，测定不同波长下酶促反应产物的A值。从图1可见，最大吸收峰在605nm，因此在比色分析中，测定波长选择605nm。取3.5mL酶液于锥形瓶中，在40℃水浴中恒温10min，加入0.5mL显色剂，40℃水浴中继续恒温。在605nm波长下，分别测定显色10、20、30、40、50、60、70、80min时产物的A值。结果见图2。图2结果显示，在0~20min内反应速率增大得很快，20min后，反应速率增加缓慢。本实验选择1~4min吸光度值的变化进行酶促反应计算。

3.2盐的种类和浓度对酯酶活力的影响

改变提取剂的种类、浓度及pH值提取苜蓿酯酶，分别测定总酯酶活力和比活力，结果如图3和图4所示。从图3和图4中可见，用pH值7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液提取的酶液活性和比活力均最高。

3.3温度对酯酶活力的影响

当其他试验条件不变时，分别测定显色温度为4、10、20、30、40、50、60、70、80℃时产物吸光度值。温度对酯酶活力的影响如图5所示。从图5中可见，40℃时，酯酶活性最高。

3.4pH值对酯酶活力的影响

在40℃时，分别测定pH值为4.0~9.0的缓冲体系中的酯酶活力，结果如图6所示。由图6可见，苜蓿酯酶在pH值6.5~7.5范围内活力较大，在pH7.0的缓冲体系中活力最大。

3.5料液比对酯酶活力的影响

4℃下用pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液为提取剂，以不同料液比(1:1~1:40)提取苜蓿酯酶，并测定总酯酶活力和比活力，结果如图7所示。从图7中可以看出，当料液比在1:1~1:10范围时，随着料液比的增加，苜蓿总酯酶活力也随之增大，这是因为料液比增大，酯酶溶出充分。而当料液比达到1:10后再增大时，总酯酶活力不再增加，可能是稀释倍数过大造成的。

3.6提取时间对酯酶活力的影响

提取率随着提取时间的延长而增高，但酶活性会随着时间的延长而降低。为了确定合适的提取时间，固定其他提取条件和显色条件，改变提取时间，以确定本试验最佳提取时间，结果如图8所示。从图8中可以看出，提取前10min，酯酶活力随提取时间的增加而增大，10min后随着提取时间的延长而逐渐降低，在提取10min到30min时，酶活相差不大，过了30min后酯酶活性降低速度加快。这是因为延长提取时间，有利于酯酶的溶出，而时间过长，酶活力损失过大。

3.7几种常见的有机磷农药的最低检测限(LDC)

从表1中的结果可看出，苜蓿酯酶对上述5种有机磷农药的LDC除甲拌磷外均远小于我国和欧盟对上述农药最高允许残留量(MRL)的要求，虽然甲拌磷的检测限高于要求，但远低于目前快速检测用小麦酯酶对甲拌磷的检测限0.166μg/mL[6]。

4结论

本实验从来源广、价格相对低廉的苜蓿中提取植物酯酶，实验表明用pH7.0的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液提取的酯酶活性最高，40℃时酯酶反应活性最大。苜蓿酯酶对久效磷、氧乐果、甲基对硫磷、甲胺磷、甲拌磷的最低检测限分别为0.024、0.050、0.009、0.003、0.002μg/mL。除甲拌磷外，对其余4种有机磷农药放入检测限均低于于我国和欧盟对上述农药最高允许残留量的要求。由于本实验只是以5种有机磷农药为例，所以该结论还需进一步选取更多种类的有机磷农药加以验证。