柑橘果胶抗癌评价

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本文作者：陆胜民1尹颖12陈剑兵1夏其乐1张俊1作者单位：1.浙江省农业科学院食品科学研究所2.浙江师范大学化学与生命科学学院

商品化的柑橘果胶(CP)是从莱姆、柠檬、葡萄柚、甜橙等柑橘果皮中所提取的一种复杂多聚糖的长链碳水化合物，分子质量一般在100ku以上。在食品工业中，柑橘果胶主要作为食品胶凝剂、增稠剂、稳定剂和乳化剂，用来制造果酱、果冻、果胶软糖、果脯、蜜饯、乳制品、罐头、果汁饮料等。研究表明，果胶具有降低血糖、血脂等作用，因此可用于生产防治糖尿病、肥胖症、高血脂等疾病的保健食品[1]。

CP作为一种水溶性膳食纤维，具有抗癌活性[2]，但由于其分子质量较大，食用后不易被肠道吸收，在人体内很难发挥抗癌功效。CP经过酸、碱、酶、高温等处理可使得其长链断裂，得到分子质量较低的低分子柑橘果胶(LMCP)。LMCP因其分子质量和酯化度较低，无分支，易被肠道吸收，并可进入血液循环进一步发挥抗癌作用[3]。

目前国际上还没有统一的LMCP产品标准，主要通过pH修饰法对果胶多糖进行水解而制得。其中碱水解主要是引起皂化，降低果胶糖链的酯化度；酸水解主要是引起多糖链中糖苷键的断裂，使原本的多糖长链降解为低分子质量片断[4-5]。不同浓度的酸、碱，不同的处理时间所得果胶在得率、分子质量和酯化度上都会有所不同[6]。采用高温处理CP制备LMCP的方法，具有操作简单易行，且无任何毒副作用的优点。本文以高温处理法制备LMCP，并测定其分子质量、半乳糖醛酸含量、酯化度和体外抗人前列腺癌激素不依赖型PC3细胞活性，以期为进一步开发LMCP抗癌辅助侯选药物或功能性食品提供基础。

1材料与方法

1.1试剂与仪器

柑橘果胶：浙江衢州果胶有限公司；半乳糖醛酸、葡聚糖分子质量标准品、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司；DMEM培养基、胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；其他试剂均为分析纯。Waters515型凝胶色谱仪：美国Waters公司，TOSOHBIOSEPG4000SWXL柱，Waters2410示差折光检测器；UV-1800紫外分光光度计：岛津公司；Model3111型CO2培养箱：ThermoFisher公司；Model680型酶标仪：BioRad公司。

1.2试验方法

1.2.1LMCP的制备

称取CP30g，置于5L三角瓶中，加少量95%酒精湿润，然后加入3L沸水，搅拌溶解。待果胶溶解完全后，经100目滤布过滤，滤液进行旋转蒸发，浓缩至原液的1/3。浓缩后的果胶液经121℃高温处理30min，自然冷却后于-20℃冰箱中冷冻2~3h，再于-78℃冰箱中冷冻3h，最后进行冷冻干燥，样品粉碎后即得到LMCP。

1.2.2半乳糖醛酸(GalA)含量的测定

采用间羟基联苯法测定半乳糖醛酸含量[7]。取1.0mg/mL半乳糖醛酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容，再分别取上述定容的溶液各1.0mL置于20mL具塞试管中，置于冰水浴中，加入四硼酸钠-硫酸溶液5.0mL，用旋涡混合器混匀，于沸水浴中加热5min，冰水浴中冷却后用微量加样枪加入1.5mg/mL间羟基联苯溶液100μL，混匀后振摇5min，超声除去气泡。以1mL蒸馏水同上操作制得空白液调零，在524nm波长处测定吸光度。以标准糖醛酸质量浓度ρ(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准工作曲线，分别称取待测定样品0.05g，置于50mL容量瓶中，定容，再分别量取0.5mL溶液，置于10mL容量瓶中定容，按标准曲线制作的方法进行样品含量的测定，计算公式：（略）。

1.2.3酯化度(DE)测定

采用化学滴定法测果胶酯化度[8]。称取5g果胶样品到250mL锥形瓶中，加入5mL的浓盐酸和100mL60%的乙醇，振摇10min。真空抽滤，每次用15mL的浓盐酸和60%乙醇混合液(1:20，v/v)洗涤6次，再用60%的乙醇洗涤直至没有明显不溶物溶出为止。然后用20mL无水乙醇洗涤后，在60℃干燥2h，冷却，称重。称取500mg干燥后的样品到250mL锥形瓶中，加入2mL乙醇和100mL不含二氧化碳的沸水。盖上盖子振摇直至果胶完全溶解或已经水解为止。加入5滴酚酞指示剂，用0.1mol/L的NaOH溶液标定，记录标定体积V1。加入20mL0.5mol/L的NaOH溶液，塞紧，剧烈振摇15min。加入20mL0.5mol/L的HCl溶液，摇晃直至粉红色消失，加入3滴酚酞指示剂，用0.5mol/L的NaOH溶液标定至淡粉红色，记录标定体积V2。酯化度为：E=V2/(V1+V2)。

1.2.4分子质量的测定

采用高效凝胶色谱法测定分子质量[9]，Waters515型凝胶色谱仪选用TOSOHBIOSEPG4000SWXL型色谱柱和Waters2410示差折光检测器。流动相为0.2mol/L硝酸钠溶液，流速为0.5mL/min，柱温40℃，进样浓度为50μg/μL，进样体积为50μL。

1.2.5抗前列腺癌细胞活性的测定

人前列腺癌PC3细胞购自中科院上海细胞库，细胞活性抑制检测方法为MTT法[10-12]。用含10%胎牛血清、100U/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液，于37℃、5%CO2并饱和湿度的培养箱中传代培养。取对数生长期PC3细胞，调整细胞悬液浓度为4×104/mL，每孔100μL细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μL/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组以及5个浓度受试药物组。继续培养72h后每孔加入100μLMTT(1mg/mL，以DMEM培养液溶解)，37℃培养4h，弃去各孔内液体后加入150μL酸化异丙醇(含0.04mol/L盐酸)，避光放置30min，酶标仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对PC3细胞的增殖抑制率，并以孙瑞元[13]教授编写的NDST(NewDrugStatisticalTreatment)计算机程序计算受试物对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC50)，细胞生长抑制率公式如下：（略）。

2结果与分析

2.1LMCP特性分析

2.1.1半乳糖醛酸含量

果胶分子主链为带负电荷的半乳糖醛酸链，半乳糖醛酸的含量影响果胶的电荷、酸碱性、成胶性及钙离子结合等物理性质。本实验采用的是间羟基联苯法测定半乳糖醛酸含量，此方法稳定性好，标准曲线线性较好，而传统的“硫酸-咔唑法”容易受到中性己糖和戊糖的干扰。半乳糖醛酸标准曲线见图1。图2显示，天然CP的半乳糖醛酸含量的平均值为64%，经过高温处理后，LMCP半乳糖醛酸含量的平均值为78%，上升了21.88%。这可能是因为经过高温处理后，果胶酯化度降低，原本以酯化形式存在的半乳糖醛酸羧基变成了游离的羧基，使得半乳糖醛酸的含量上升。

2.2.2酯化度含量

酯化度决定着果胶的溶解度、凝胶能力和凝胶条件以及在特定pH下的稳定性。从图2可知，原料CP酯化度为59%，LMCP的酯化度为38%，下降35.6%。Jackson等[14]通过对商品名为PectaSol的市售改性柑橘果胶(MCP)的研究发现，PectaSol不具备前列腺癌细胞凋亡诱导作用，可能是经过碱处理后同型半乳糖醛酸聚糖(HG)含量过高或酯化度过低所致。因此，低分子柑橘果胶酯化度并非越低越好，适度降低酯化度可增大溶解性，酯化度的降低也会改变果胶的一些理化性质，但是LMCP作为抗癌药物的备选物，其酯化度降低的利弊以及降低多少适宜还需要进一步的研究。

2.2.3分子质量测定

以不同分子质量的葡聚糖为标准品制作标准曲线，并在相同条件下分别对高温处理前后的样品进行分析，得到果胶热处理前后的分子质量分布如图3、表1所示。可知，经高温处理后果胶分子质量明显降低，其Mn、Mw和Mp均低于10ku。

2.3药理活性

未经高温处理的CP抗前列腺癌细胞活性见表2，经过高温处理后制得的LMCP抗前列腺癌细胞活性见表3。由表2可知未经高温处理的CP本身就具有一定的抑制癌细胞增殖的能力，且高剂量下(5~10mg/mL)抑制率达40%以上，对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC50)为(6.68±0.05)mg/mL。从表3可知，经过高温处理后制得的LMCP对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC50)为(3.55±0.44)mg/mL，相对于CP，其IC50降低了48.86%。虽然天然的CP具备一定的抑制癌细胞增殖的能力，然而，高剂量的CP不易被人体细胞吸收，实际进入体内作用于癌细胞的可能性较小。比较表2和表3可知，中剂量(2.5mg/mL)下两者抑制率很接近，但高剂量(5、10mg/mL)下LMCP对PC3的抑制率远大于CP，且半数抑制浓度(IC50)明显低于CP，即表明经过高温处理后，抗前列腺癌细胞活性的能力显著增强。试验发现低剂量(0.625、1.25mg/mL)下LMCP对癌细胞增殖的抑制率为负值，由此推断LMCP具有一定的营养作用，对正常细胞无毒害作用。相关研究报道表明低分子果胶抗癌主要是通过抑制癌细胞的生长、转移、侵袭和血管生成等多种活性[15]，并且具有一定的选择性。张文博等[16]研究了MCP对肝癌U22细胞、宫颈癌U14细胞和肉瘤S180细胞的抗性，发现MCP对前两种癌细胞有抗性，但对肉瘤S180细胞没有抑制活性。

3结论

以天然柑橘果胶为原料，通过121℃处理30min可将果胶分子质量降到10000u以下，半乳糖醛酸含量为78%，酯化度为38%的低分子柑橘果胶。细胞试验表明制得的低分子柑橘果胶的对PC3细胞有很强的抑制作用，中剂量(2.5mg/mL)下抑制率可达38%，高剂量(5~10mg/mL)下抑制率达80%~90%，肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度为(3.55±0.44)mg/mL，相对于天然的柑橘果胶，其抗前列腺癌细胞活性显著增强。