回锅油品质验证
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本文作者：袁美娟薛文通作者单位：中国农业大学食品科学与营养工程学院
回锅油又称“万年油”，泛指长期使用后，变色变质劣化后的食用油。常见特征是油质偏混浊，颜色深，甚至变黑(或存在明显的油炸过后的悬浮物)，搅拌时明显地黏稠等，嗅觉较灵敏的人甚至可闻出异味。但回锅油并不等于“地沟油”、“馊水油”，回锅油可能来自大豆色拉油、棕榈油、玉米油、花生油、葵花油等，属于长期使用过后的炸油。这种油新旧掺杂或用于烧菜或用于火锅底料，不仅营养物质大大减少，还产生了环氧化合物等致癌物质。本工作拟用高效液相色谱(HPLC)测定回锅油中的主要脂肪酸成分，验证所使用的油的营养价值，间接验证使用的食用油是否是回锅油。同时利用测得的游离脂肪酸的质量间接验证回锅油的酸价。为寻找快速检测回锅油的方法提供不一样的思路。
1材料与方法
1.1材料与试剂
亚麻酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸标准品、衍生化试剂2,4-二溴苯乙酮、相转移催化剂18-冠-6醚：上海Sigma-Aldrich贸易有限公司；色谱甲醇：德国Merck试剂公司；色谱乙腈：美国Fisher试剂公司；色谱二氯甲烷：天津津科化学试剂公司。EclipseXDB-C18柱：美国安捷伦科技有限公司。
1.2色谱条件
流动相：乙腈:水(90:10)；体积流量1.5mL/min；柱温：33℃；检测波长254nm；进样量20μL，利用外标法进行定量分析。
1.3衍生化处理
准确称取等量的2,4-二溴苯乙酮和18-冠-6醚配制成1mg/mL的衍生化溶液，置于4℃条件下避光保存。分别称取亚麻酸、硬脂酸、油酸、棕榈酸和亚油酸0.2226、0.3208、0.2971、0.2468、0.2880g，以甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)混合溶液定容至100mL待用。取上述脂肪酸标准溶液0.15mL于具塞反应管中，加入相应浓度的衍生化试剂3mL，另加入0.4g碳酸钾已形成pH值为8.3～8.5的缓冲体系。混合物于80℃水浴中加热30min，反应液置于4℃条件下冷却1h，过0.45μm滤膜后，待HPLC分析[1]。
1.4样品前处理
1.4.1非皂化处理(测游离脂肪酸)
称取样品0.5g，以甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)混合溶液定容至5mL，加入1g无水硫酸钠脱水，4200r/min离心5min，取上清液0.15mL，按上述中脂肪酸标准品衍生化步骤处理，所得样品待HPLC分析[2]。
1.4.2皂化处理(测总的脂肪酸)
精确称量样品0.5g，加入30mL无水乙醇、3mL50%KOH水溶液、2mL10%抗坏血酸水溶液，超声10min，75℃回流皂化1.5h，用蒸馏水和石油醚冲洗皂化瓶并入分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次30mL，弃去石油醚层，保留水层；调节水层pH4.0，使脂肪酸盐转为脂肪酸；用石油醚萃取3次，每次30mL，合并石油醚层，于55℃水浴中减压蒸馏并回收石油醚，将瓶中剩下约2mL石油醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉石油醚，加无水硫酸钠干燥，用甲醇定容5mL，待测[3]。
2结果与分析
2.1标准曲线的建立
脂肪酸标准溶液中加入浓度为1mg/mL的衍生化试剂，按1.3方法制成脂肪酸衍生物贮备液30mL，分别取贮备液8、6、5、3、1mL用甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)混合溶液定容至10mL配制成不同梯度溶液的混合标准溶液，按1.2所述色谱条件依次进样分析。并不断稀释最低浓度标准溶液，以信噪比为10时的浓度作为检测定量限，以信噪比为3时作为检测限。以Y(峰面积105)为纵坐标，以X(质量浓度mg/mL)为横坐标进行线性回归。结果表明，亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸线性关系良好，各曲线回归方程、相关系数、线性范围以及检测限和定量限如表1所示。
2.2精密度实验
按1.3所述方法制备脂肪酸标准样品，连续进样6次，记录每次脂肪酸峰面积，所得亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸与硬脂酸精密度相对标准偏差(RSD%)分别为1.2%、1.4%、1.0%、1.1%和1.0%。
2.3稳定性实验
脂肪酸衍生化样品置于4℃条件下，每隔2h进样1次，进样6次，记录每次脂肪酸峰面积，计算所得亚麻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸与硬脂酸稳定性的相对标准偏差(RSD%)分别为1.5%、1.5%、0.9%、1.3%和0.7%。
2.4重现性实验
分别称取样品0.5g(3份)，制备脂肪酸衍生化溶液，各进样2次，计算5种脂肪酸含量，考察方法重现性。计算所得5种脂肪酸含量的相对标准偏差RSD%分别为1.5%、0.6%、2.2%、4%、3.3%。
2.5专一性考察
分别配制样品油，亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸对照品的衍生化产物及空白溶液(空白溶液的制备：加入2,4—二溴苯乙酮和18-冠-6醚混合溶液3mL及甲醇和二氯甲烷1:1(v:v)的混合溶液0.15mL，另加入0.4g碳酸钾)进液相色谱分析。可见在空白中亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸处均无干扰，亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸分离度好。
2.6回收率实验
精确称量样品0.5g(3份)，加入亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸混合标准液2mL，再加入30mL无水乙醇、3mL50%KOH水溶液、2mL10%抗坏血酸水溶液，超声10min，75℃回流皂化1.5h，用蒸馏水和石油醚冲洗皂化瓶并入分液漏斗中，用石油醚萃取3次，每次30mL，弃去石油醚层，保留水层；调节水层pH4.0，使脂肪酸盐转为脂肪酸；用石油醚萃取3次，每次30mL，合并石油醚层，于55℃水浴中减压蒸馏并回收石油醚，将瓶中剩下约2mL石油醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉石油醚，加无水硫酸钠干燥，用甲醇定容10mL，待测。计算所得亚麻酸、油酸、棕榈酸、亚油酸与硬脂酸加样回收率分别为98.2%、95.1%、96.5%、95.7%、97.1%。
2.7样品中脂肪酸含量
将食用花生油每天连续煎炸2h，然后放置过夜，如此反复取5次样，测定其中脂肪酸成分。花生油中亚麻酸、亚油酸和油酸等不饱和脂肪酸占到85%以上，是花生油具有营养价值的主要原因。人体所需要的不饱和脂肪酸主要是从食用油中供给，因此食用油的营养价值大小至关重要。通过实验发现，花生油中的不饱和脂肪酸在前2h的煎炸过程中下降最快，只占到17%。随后的过程中却变化不剧烈，这有可能是因为油脂此时的主要变化是进行聚合反应，分解氧化反应缓慢。建议食用油煎炸不要超过2h，尤其颜色发生变化后要丢弃不再用。
3讨论
一种较普遍的观点认为：天然油脂的环氧化反应是在双键上发生的，并得到环氧基和羰基。“高碘值双键氧化理论”强调的是：碘值越高双键越多，且双键越易氧化。这种观点没有考虑双键的相对位置、构型、活性基等，包括活性基引入后对结构的反作用。假如油脂氧化发生在双键上，必然导致双键破坏或是氧化后的油脂碘值会发生明显下降。在我们的实验条件下，对样品油进行过氧化值和碘值的测定，发现过氧化值的增加和碘值的下降不成比例。在用高效液相色谱对样品中的脂肪酸成分分析时发现饱和脂肪酸并没有增加，而是都降低，营养价值急剧下降。与测定的碘值不一致，说明氧化反应以非双键反应为主。这些结论与周华龙[4]等人的结论一致。不论是鱼油还是植物油脂，不管是精制的色拉油还是普通的未精制油脂，经深度氧化，过氧化值达到极大值后，实际新增的游离酸很小，一般在4~10mgKOH/g。这说明油脂氧化生成氢过氧化物是主要反应，酸败是氧化反应物的二次反应的结果。在用高效液相色谱分析样品的游离脂肪酸时(非皂化)，其游离酸的含量很少，与酸价的测定结果一致。以上的结果说明可以利用高效液相色谱验证食用油的营养价值，并判断是否是回锅油即是否是二次用油。同时，需要更精确快速的方法来检测回锅油并与其他方法结合互相验证。
