青霉素Na分解条件探究

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本文作者：魏宝东1李强1齐欣2作者单位：1.沈阳农业大学食品学院2.大连出入境检验检疫局庄河分中心

β-内酰胺酶(β-lactamase)，俗称抗生素分解剂，又名解抗剂或金玉兰酶制剂，是β-内酰胺类抗生素耐药菌株分泌的一种胞外酶[1]，该酶可选择性分解β-内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶破坏β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环有2种作用机制：第一，依赖丝氨酸发挥作用的机制。此类β-内酰胺酶包括分子生物学分类方法中的A、C、D3类酶[2-3]，本研究所用酶属于A类酶中的TEM型。它们的活性位点具有1个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔(氧阴离子袋)，构造疏松，容易弯曲，便于结合底物。由于β-内酰胺环上的羰基碳在结合β-内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，使其成为开环物，重建了β-内酰胺酶。这类酶对青霉素、头孢菌素和单内酰环类抗生素都有降解作用。第二，依赖金属离子的机制。这类酶是指金属类β-内酰胺酶(B类β-内酰胺酶)，其作用机制是利用一个二价金属离子(多为锌离子)，分别与半胱氨酸或组氨酸结合，或同时与二者结合，并与β-内酰胺类抗生素的羰基碳的酰胺键相互作用，使其不能发挥作用[2-3]。此类酶主要对青霉素、头孢菌素、碳青酶烯类抗生素有作用，但对单内酰环类抗生素无效。青霉素在β-内酰胺酶作用下，酶中亲核性基团向β-内酰胺环进攻，开环后可脱羧重排生成中间体青霉噻唑酸，同时伴随生成青霉稀酸、青霉酸、青霉胺、青霉醛等小分子物质[4]。如果在牛奶中使用了解抗剂来降解添加的抗生素，会使检测结果呈现假阴性。为了杜绝假阴性现象的出现，对青霉噻唑酸的检验就显得至关重要。一方面，青霉噻唑酸具有半抗原的性质，可以用作酶联免疫研究，制成快速检测的试剂盒，以保障原料乳的安全。另一方面，经过纯化的青霉噻唑酸可以作为标准物质，建立高效液相色谱的检测方法，从而对原料乳中的青霉噻唑酸进行定性和定量检测，杜绝抗生素过量添加的现象。本研究用β-内酰胺酶对青霉素钠进行降解，探讨了不同降解条件对降解效果的影响，并优化得出了具体工艺参数，可以为青霉噻唑酸的制取提供必要的工艺参考，同时为青霉噻唑酸的检测研究提供基础。

1材料与方法

1.1试剂

注射用青霉素钠：哈药集团制药总厂；注射用舒巴坦钠：华北制药股份有限公司，用pH7.0的na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制成浓度为2.0mg/mL的溶液；β-内酰胺酶(酶活≥1000U/mg)：上海晶纯试剂有限公司，用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制成浓度为500U/mL的酶液；牛肉浸膏、蛋白胨：生化试剂，北京奥博星生物技术有限公司；琼脂：福建泉州市泉港化工厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2指示菌种

大肠杆菌：沈阳农业大学食品学院保存。

1.3培养基

营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.2~7.4。

1.4仪器与设备

SYQ-DSX-280A型手提式压力蒸气灭菌器：上海申安医疗器械厂；DHG-9006型电热恒温鼓风干燥箱、DK-S26型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养箱：南京电器三厂；牛津杯(外径8mm)；培养皿(90mm)。

1.5试验方法

1.5.1抑菌效果试验

采用杯碟法[5-7]。取大肠杆菌原菌种，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，37℃培养20h。用10mL无菌水洗下菌苔，制成浓度约为109cfu/mL的菌悬液。用无菌枪头吸取100μL菌悬液，加注到无菌的琼脂平板中，立即用无菌涂布棒均匀涂布，制成含菌平板。在平板中央放置1个牛津杯，用无菌枪头吸取200μL降解液小心地注入到牛津杯中，置于37℃的条件下培养20h，观察抑菌效果。

1.5.2温度对青霉素钠降解的影响

取6支试管分别加入注射用青霉素钠10mg，用pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制成浓度为2.0mg/mL的溶液。每支试管中加入β-内酰胺酶60U，分别在35、36、37、38、39、40℃的条件下降解60min，降解完成后立即加入0.5mL舒巴坦钠以终止酶解反应。

1.5.3降解时间对青霉素钠降解的影响

将6支试管分别置于37℃的恒温水浴锅中降解40、50、60、70、80、90min，其他操作不变。

1.5.4酶用量对青霉素钠降解的影响

试管中分别加入β-内酰胺酶55、60、65、70、75、80U，置于37℃的恒温水浴锅中降解60min，其他操作不变。

1.5.5降解体系pH对青霉素钠降解的影响

分别考察降解体系pH值为5.8、6.1、6.4、6.7、7.0、7.3时的降解情况，其他操作不变。

1.5.6酶降解条件的优化

在酶解条件单因素试验的基础上，对降解温度、降解时间、酶用量和降解体系pH值4个因素进行L9(34)正交试验，以降解液的抑菌情况为指标，对酶解条件进一步优化，探索出β-内酰胺酶降解青霉素钠的最佳条件组合。因素水平如表1所示。

2结果与分析

2.1温度对青霉素钠降解的影响

不同温度下降解液的抑菌效果如表2所示。由表2可以看出，当降解温度＜37℃时，有抑菌圈产生。这是因为此时温度偏低，分子活动温和，β-内酰胺酶分子和青霉素钠分子之间碰撞的机会偏少，造成β-内酰胺酶未与青霉素钠有效地结合，青霉素钠未被完全降解。随着温度的升高，酶的反应速度成倍增长，当温度在37~39℃时，分子活动剧烈，酶和底物分子之间的碰撞机会增加，青霉素钠被完全降解，失去抗菌活性，故无抑菌圈出现。当温度达到40℃时，过高的温度导致部分酶蛋白发生不可逆失活，其催化作用受到影响，使得青霉素钠的降解反应未进行完全，降解液仍存在抗菌活性。因此，在37~39℃范围内均可作为β-内酰胺酶降解青霉素钠的最佳温度选择。

2.2降解时间对青霉素钠降解的影响

不同的降解时间会对青霉素钠的抗菌活性造成不同的影响，表3为青霉素钠经过不同的降解时间后，降解液的抑菌情况。酶催化反应的动力学表明，酶解是一个有一定时间差的过程，当酶解产物累积到一定浓度后会对酶产生反馈抑制，反应速度也会随之变慢，所以酶解并非时间越长越好。由试验结果可以看出，当降解时间为40min和50min时，酶解反应并未进行完全，降解液中仍有部分青霉素钠，故有抑菌圈出现。当降解时间达到60min时，β-内酰胺酶有足够的时间同青霉素钠结合，进攻β-内酰胺环，β-内酰胺环全部被破坏，失去抗菌活性。同理，降解时间＞60min时，β-内酰胺酶则更能充分发挥催化作用，降解反应进行完全，所以经过60～90min的降解后，都没有抑菌圈出现。考虑到时间因素和试验的便利程度，选择60min作为最佳降解时间。

2.3酶用量对青霉素钠降解的影响

不同的酶用量对青霉素钠的降解效果不同，实验结果如表4所示。当酶用量为55U时，酶量相对不足，酶分子全部与青霉素钠分子结合，但仍有部分青霉素钠分子未与β-内酰胺酶相结合，这部分青霉素钠未被降解，仍然保持抗菌活性。当酶用量为60U时，酶分子的数量已经足够与所有的青霉素钠分子有效结合，催化反应速度加快，青霉素钠完全被降解，抗菌活性消失，故酶用量在60~80U时，抑菌试验都没有抑菌圈出现。考虑到成本因素，选取最佳酶用量为60U即可。

2.4降解体系pH值对青霉素钠降解的影响

不同降解体系pH值会对降解反应的进行程度造成不同的影响，实验结果如表5所示。pH值对降解反应的影响主要体现在对β-内酰胺酶空间构象的影响上，因为酶的本质是蛋白质，pH值的改变会改变酶分子的空间构象，极限pH会导致酶丧失活性，使酶的催化作用受到影响。由试验结果可以看出，当降解体系的pH值为5.8~6.4时，缓冲液呈弱酸性，β-内酰胺酶的空间结构遭到破坏，引起酶构象的改变，因此其活性受到部分抑制，又因为青霉素在降解过程中主要生成青霉噻唑酸，青霉噻唑酸是一种强酸，也会对磷酸盐缓冲体系造成一定的冲击，所以在此条件下β-内酰胺酶部分变性失活，致使青霉素钠未被完全降解，依然存在一定的抑菌活性。而当降解体系的pH值在6.7~7.0时，达到了β-内酰胺酶作用的最适pH范围，其催化效率提高，可以使青霉素完全被降解，抗菌活性丧失。当降解体系的pH值为7.3时，溶液呈弱碱性，一方面可能会影响到β-内酰胺酶活性部位催化基团和结合基团的解离状态，另一方面青霉素钠本身在碱性条件下容易发生水解反应，对β-内酰胺酶的降解作用造成一定程度的掩盖，所以不宜选择7.3作为降解体系的最适pH值。故选择7.0作为β-内酰胺酶降解青霉素钠的最适降解pH值。

2.5酶解条件的优化

运用正交试验对酶降解条件进行优化，结果如表6所示。由正交试验的结果可看出，处理4、6、8均没有抑菌圈出现，说明3个处理均可以使青霉素钠完全降解。但在处理4和处理8中，降解体系的pH值都是7.3，青霉素钠在此条件下容易引发自身水解反应，对试验结果造成一定的偏差，所以不宜选择处理4和处理8作为最佳酶解条件组合。在处理6中，酶解时间需要75min，仅比处理4多10min，处在可接受的范围内，而且加酶量为60U，比起处理8更能节约成本。综合以上分析，选择处理6为酶解条件的最优组合，即β-内酰胺酶降解注射用青霉素钠的最优条件组合为：降解温度37℃、降解时间75min、酶用量60U、降解体系pH值7.0。

3结论与讨论

研究发现，降解温度、降解时间、酶用量和降解体系pH值均能对β-内酰胺酶降解青霉素钠造成一定程度的影响，通过单因素试验和正交优化试验确定了降解的最佳条件组合为：降解温度37℃、降解时间75min、酶用量60U、降解体系pH值7.0，在此条件下，青霉素钠可以被完全降解，失去抗菌活性。β-内酰胺酶是一个复杂的酶系，降解完成后对它的灭活是一个棘手的问题。由于青霉素钠分子中存在β-内酰胺环结构，决定了它的高度不稳定性[8-9]，所以不能用高温加热的方法灭活降解液中的β-内酰胺酶。有机溶剂、重金属离子则有可能对指示菌的生长造成一定的影响，使试验结果出现偏差，故常规的灭活方法均不可用于本研究中β-内酰胺酶的灭活。本研究中选择β-内酰胺酶的特异性抑制剂舒巴坦来抑制其活性，以终止降解反应。舒巴坦是一个广谱酶抑制剂，在较低浓度时，即可对II、III、IV和V型β-内酰胺酶具有很强的不可逆抑制作用[10]，其作用原理为首先通过与β-内酰胺酶作用形成酰化产物I，然后I的噻唑环开环生成中间体II，II重排后得到不易水解的β-氨丙稀酸类化合物III，酰化产物I及其开环生成的中间体II可水解得到活化酶和水解产物，II和III还可进一步转变为不可逆失活产物，而使酶失活[11]。而且，经过试验，舒巴坦并未对指示菌的生长造成明显的影响，作为降解反应的终止剂可以放心使用。但是，高浓度的舒巴坦对于指示菌的影响程度如何，仍需要进一步的研究。β-内酰胺酶虽然在一定条件下可以对青霉素等抗生素进行完全降解，但这并不意味着在实际生产中可以通过添加β-内酰胺酶的方式来生产“无抗奶”。因为，一方面β-内酰胺酶的食用安全性尚未得到准确的论证，另一方面抗生素的降解产物可能对人类健康造成潜在的威胁，引起诸如过敏之类的症状。卫生部已经明确指出“添加β-内酰胺酶(解抗剂)等非食品用物质属违法行为”。尽管如此，仍有一些不法生产者为了牟取超额的经济利润，人为地添加解抗剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。目前，目前国家还未出台β-内酰胺酶的国标检测方法，面对越来越严重的解抗剂滥用现象，建立快速、准确的检测方法迫在眉睫。