抑制肽制备方法探究

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本文作者：芦鑫1,2孙强1,2宋国辉1,2张丽霞1,2李婧1黄纪念1,2作者单位：1.河南省农科院农副产品加工所2.河南省农产品生物活性物质工程技术研究中心

花生是世界上广泛种植的油料作物，2009年全球花生产量为34.40×106t。我国是花生的生产大国和消费大国，花生产量居世界第一，年均消费花生在12.56×106t[1]。目前，我国用于制油的花生占花生总消费量的一半以上，由此产生大量的花生饼粕。研究发现花生饼粕中含有多种营养成分，其中花生蛋白的含量超过40%。花生蛋白含有人体所需的8种必需氨基酸，消化性可达99%，是一种营养价值高、资源丰富的植物蛋白资源[2]。但当前我国花生饼粕主要用于动物饲料，资源未得到充分利用，造成资源浪费。因此，国内外开展从花生粕中提取加工花生蛋白的研究工作，其中将花生蛋白水解制备功能性花生肽是研究的热点[3-5]。研究表明，以花生蛋白为原料制备的功能性肽具有明确的降血压(ACE抑制)活性。但目前制备ACE抑制花生肽的工艺以直接加酶水解为主，这种制备方式造成酶活力的浪费，增加生产成本，不利于工业化推广。由此，本文尝试采用固定化酶技术将碱性蛋白酶2709固定后，以ACE抑制率与短肽生成率作为评价指标，采用响应面技术优化酶解条件，获得最佳的酶解条件并分析酶解程度与ACE抑制活性之间的关系，为花生功能性肽的工业化生产提供理论指导。

1材料与方法

1.1材料与试剂

低温花生饼粕：蛋白质含量57.60%，水分含量6.53%，油脂含量5.63%，灰分4.90%，河南亮健科技有限公司；碱性蛋白酶2709：酶活225303μ/g，郑州分子科贸有限公司；牛血清白蛋白、2,4,6-三硝基苯磺酸(TBNS)、马尿酰组氨酰亮氨酸(Hippuryl-His-Leu，HHL)、血管紧张素转换酶、邻苯二甲醛(o-Phthaldialdehyde，OPA)、考马斯G250：美国Sigma公司；壳聚糖、磷酸二氢钠、戊二醛、磷酸氢二钠、氢氧化钠等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

ZDDN-Ⅱ全自动凯氏定氮仪：浙江托普仪器有限公司；CaryEclipse荧光光度计：美国瓦里安公司；DGX-9243型鼓风干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；LyovacGT1冷冻真空干燥机：德国SRK公司；DL-5-B离心机：上海安亭科学仪器厂；TGL-16A离心机：金坛市亿通电子有限公司；XS205电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；ΜV-2802型紫外可见光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；XW-80A漩涡混合器：上海青浦沪西仪器厂；DF-101S集热兼磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂；ZW-A微量振荡器：常州博远实验分析仪器厂等。

1.3实验方法

1.3.1花生蛋白的制备

取一定质量的低温花生饼粕，按照料液比1:10(w/v)加入pH为10.0的氢氧化钠溶液，25℃下恒温搅拌3h，随后4000r/min离心20min，回收上清液并测定上清液的体积。将残渣重新倒入烧杯中，加入与上清液相同体积的pH10.0的氢氧化钠溶液，采用相同的搅拌和离心条件，合并1次和2次离心的上清液，采用0.5mol/L的HCl调节上清液到pH4.40，4℃静置6h，4000r/min离心20min，水洗沉淀，冷冻干燥。

1.3.2碱性蛋白酶2709的壳聚糖固定

取一定量的壳聚糖，按料液比1:40(w/v)加入1%的醋酸溶液，室温搅拌直至完全溶解。用注射器逐滴将壳聚糖溶液加入到3倍体积含有NaOH和乙酸乙酯混合溶液中(NaOH浓度为3%，乙酸乙酯浓度为1.25%)，室温静置3h，抽滤，蒸馏水冲洗3次。将壳聚糖微球加入到1.5%戊二醛溶液中，室温搅拌3h，更换戊二醛溶液后，重新加入1.5%戊二醛溶液，4℃静置过夜，抽滤，用蒸馏水和丙酮交替多次洗涤。将活化的壳聚糖微球加入到1%碱性蛋白酶溶液，室温搅拌12h，随后抽滤除去游离蛋白酶，4℃冰箱保存，其酶活力回收率为57.12%。

1.3.3固定化酶制备ACE抑制花生肽

将花生蛋白配成5%花生蛋白溶液后，在90℃加热10min。取100mL热处理后的花生蛋白溶液加入一定量的固定化碱性蛋白酶2709，在设定温度下，恒温搅拌若干时间后，取上清液测定短肽生成率、水解度和ACE抑制率，抽滤回收壳聚糖微球，酶解液4℃储存。结合前期研究，发现加酶量、酶解温度、酶解pH、酶解时间为影响酶解效果的关键因素。对以上因素的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码，随后采用SAS9.1.3软件按Box-Behnken方法安排实验条件，进行实验。

1.4测定方法

1.4.1蛋白水解度测定

取0.25mL上清液加入到试管中，随后加入2mL，浓度0.1%(v/v)TNBS和2mL0.2mol/LpH8.20磷酸缓冲液，置于水浴锅中50℃水浴振荡60min，水浴过程中，采用铝箔覆盖遮光。随后用4mL0.1mol/L的盐酸进行终止反应，室温静置30min，以L-亮氨酸作为标准曲线，采用340nm测定吸光度[6]。蛋白水解度计算公式如下：水解度(%)=h/htot×100(1)式中：h为水解物中1g被裂解肽键量，mmol/g；htot为1g原料蛋白质总肽键量，mmol/g；花生蛋白的htot为7.49mmol/g[7]。

1.4.2短肽得率测定

参照赵世光等人的方法，并稍作修改[8]。取2.5mL酶解液，加入等体积10%(w/v)的三氯乙酸，混匀，4℃静置30min，采用10000r/min离心20min。取离心后上清液和酶解液适当稀释，采用考马斯亮蓝G-250测定肽类质量和蛋白总质量，测定波长为595nm，以牛血清白蛋白做为标准蛋白。肽链得率(%)=(肽链质量/上清液中蛋白总质量)×100

1.4.3ACE抑制活性测定

将酶解液适当稀释，使用96孔酶标板作为反应容器。将20μL样液(无抑制的反应液中以蒸馏水代替)与40μL底物溶液(底物是4.66mmol/LHHL的氯化钠磷酸缓冲液)混合，然后加入40μL酶活浓度为12.5mU/mLACE酶液(对照液中以蒸馏水代替)，在微孔板混合器上混匀后置于37℃恒温箱中反应1h，然后加入1.2mol/LNaOH溶液150μL终止酶反应。接着在反应液中加入2%OPA甲醇溶液40μL，混合均匀，室温下静置20min后加入6mol/L的HCl溶液40μL终止衍生反应。将上述溶液稀释50倍后，测定荧光吸收强度，测定的激发波长340nm；发射波长为455nm；狭缝宽度为5nm。样液的ACE抑制活性的计算公式如下：ACE抑制率(%)=[1-(a-c)÷(b-d)]×100(2)式中：a为抑制剂与ACE都存在时的荧光吸收强度；b为抑制剂不存在而ACE存在时的荧光吸收强度；c为抑制剂存在而ACE不存在时的荧光吸收强度；d为抑制剂与ACE都不存在时的荧光吸收强度。ACE抑制率越大，表明该样品的ACE抑制活性越强。

1.4.4其他测定方法

低温花生饼粕成分测定方法如下：蛋白测定采用凯氏定氮法GB5009.5—2010，N为5.46；灰分测定采用550℃灰化法GB/T5505—2008；水分测定采用105℃恒重法GB5512—1985；粗脂肪测定采用索氏抽提法GB/T14772—2008。蛋白酶酶活标定采用Folin法SB/T10317—1999，其酶活测定pH为10。

1.5数据处理

无特殊说明，实验平行测定3次。采用SAS9.1.3和MicrosoftofficeExecl2007分析和处理数据。本文中，p<0.01为高度显著，p<0.05为显著。

2讨论与分析

2.1酶解条件对短肽生成率的影响

采用SAS分析短肽生成率(见表2)发现，整个模型高度显著(p=0.0001)，这表明响应面模型真实反映客观事实；失拟项不显著(p=0.0538)，这说明没有遗漏重要的影响因子，选取的酶解因素全面；R2=98.90，调整R2=97.62%，这说明响应面模型和实际结果拟合程度好。分析影响因素发现，加酶量和酶解时间是高度显著因素(p<0.01)，酶解pH是显著因素(p=0.0171)，酶解温度是非显著因素(p=0.7779)。酶解温度是非显著因素的原因可能是固定化酶增强了碱性蛋白酶的耐热稳定性。获得的拟合曲线如下(实际值)：（略）。由于酶解温度是非显著影响因素，下面只分析加酶量、酶解pH和酶解时间对短肽生成率的影响。由图1(a)可知，当酶解温度为45℃，酶解pH为10时，固定酶解时间为120min考察加酶量对短肽生成率的作用可以发现，加酶量从1200增加到1600μ/g蛋白时，可以显著提高短肽生成率，但继续增加加酶量到2000μ/g蛋白时，短肽生成率增加缓慢。这是由于增加加酶量增加酶分子与底物之间碰撞机率，从而加速酶水解的反应速率，单位时间内提高短肽生成率。但在反应体系内，底物的酶作用位点有限，底物充分水解后，反应达到平衡，继续加入蛋白酶不能提高短肽生成率。当固定加酶量为1600μ/g蛋白时，酶解时间从60min延长120min，短肽生成率迅速上升，当酶解时间从120min延长到180min时，短肽生成率增加缓慢。这是因为酶反应刚开始时，体系中有丰富的底物可以被酶水解，此时增加反应时间，短肽生成率增加，但随着反应的进行，体系内反应底物与生成物达到动态平衡，延长反应时间也不能有效提高短肽生成率。由图1(b)可知，当酶解温度为45℃，酶解时间为120min时，固定加酶量为1600μ/g蛋白时，当酶解pH从9增加到10时，短肽生成率上升，继续增加pH到11，短肽生成率有所下降。尽管固定化酶在一定程度上提高酶对温度、pH的耐受性，但从结果来看，体系pH依然会影响固定化的碱性蛋白酶在反应体系中的构象，从而带来酶催化活性差异，从而对短肽生成率产生影响。

2.2酶解条件对蛋白水解度的影响

蛋白水解度是衡量蛋白水解程度的重要指标。响应面分析发现，模型高度显著(p=0.0001)，失拟项不显著(p=0.0515)，R2=0.9831，调整R2为0.9635，因此该模型真实反映水解度变化情况，可以进行影响因素方差分析。分析影响因素发现，加酶量和酶解时间都是高度显著影响因素(p=0.0001)，而酶解温度和酶解pH是非显著影响因素(p=0.3880和0.2218)。获得的回归方程如下(实际值)：（略）。由图2(a)所示，当酶解温度为45℃，酶解pH为10，固定加酶量分析酶解时间的影响，酶解时间从60min增加到120min，蛋白的水解度迅速增加，当酶解时间从120min延长到180min，蛋白水解度增加放缓。由于每种蛋白酶都有其特定酶水解位点，因此酶解反应是有限水解，反应达到平衡时，其水解度逐渐趋于稳定，这也是酶解时间从120min延长到180min时，蛋白水解度变化不明显的原因。当固定酶解时间分析加酶量影响时，增加加酶量有利于蛋白水解，因此获得酶解产物的水解度较高，但当加酶量继续增加，酶解反应速度加快，水解产物快速生成并在体系中浓度达到稳定，因此水解度变化不明显。

2.3酶解条件对ACE抑制活性的影响

研究表明：酶解法制备ACE抑制肽受多种因素的影响，如蛋白酶种类、蛋白底物种类、酶解条件、酶解程度等[9-10]。分析表2中的ACE抑制率结果发现：模型高度显著(p=0.0001)，失拟项不显著(p=0.0522)，R2=93.34%和调整R2=85.57%，因此模型真实客观的反映酶解产物的ACE抑制活性。方差分析发现：加酶量和酶解时间是高度显著影响因素(p=0.0001)，而酶解温度和酶解pH是非显著影响因素(p=0.7055和0.7488)，获得的回归方程如下(实际值)：（略）。加酶量和酶解时间对ACE抑制率的影响见图2(b)。由图2(b)可知，当酶解温度为45℃，酶解pH为10，固定加酶量分析酶解时间的影响发现，延长酶解时间有利于酶解液ACE抑制活性的提高，但超过140min后，ACE抑制活性有所下降。具有ACE抑制活性的多肽是蛋白酶解产物的一部分，延长酶解时间会使这部分多肽被降解，逐渐丧失ACE抑制活性，从而降低ACE抑制率。固定酶解时间分析加酶量影响发现，适量增加加酶量有利于ACE抑制肽的生成，过量的加酶量反而会使ACE抑制肽水解，导致ACE抑制率下降。

2.4短肽生成率、水解度和ACE抑制率的关系

工业化制备ACE抑制肽需要兼顾2个指标：短肽生成率和ACE抑制率。由于蛋白酶解反应复杂，会产生多种性质不同的多肽产物。因此，需要通过水解度来衡量酶解产物组成和控制酶解反应程度。在现有的实验条件下，酶解条件中加酶量和酶解时间对短肽生成率、水解度和ACE抑制率具有高度显著影响，因此以加酶量和酶解时间作为自变量，短肽生成率、水解度和ACE抑制率作为应变量作图，考察它们在酶解条件改变后，它们之间的相互关系。由图4(a)可知，随着酶解反应的进行，蛋白水解度和短肽生成率上升，且二者具有高度的正相关性，即低的水解度往往对应着较低的短肽生成率，当水解度大于18%时，短肽生成率在80%以上。由图4(b)可知，伴随着水解度的增加，酶解产物的ACE抑制活性迅速增加，但从水解度和ACE抑制率曲线变化趋势可知，过高的水解度并不对应高的ACE抑制活性。这是可能是多肽的过分水解后，丧失了ACE抑制结构，从而导致ACE抑制活性下降。由图4(c)可知，适当增加加酶量和酶解时间会提高短肽生成率和ACE抑制率，但过度延长水解过程和增加加酶量，短肽产率增加有限而ACE抑制率下降。短肽生成率最大值对应的酶解条件和ACE抑制率最大值的酶解条件不重合。通过SAS计算，获得最大短肽生成率的酶解条件为：加酶量取1765.98μ/g蛋白，酶解时间为181.61min，酶解pH为10.07，酶解温度为45.08℃，此时对应的短肽生成率为84.95%±0.60%。获得最大ACE抑制率的酶解条件为：加酶量为1766.73μ/g蛋白，酶解时间为142.26min，酶解pH为9.97，酶解温度为45.25℃，此时对应的短肽生成率为84.00%±2.87%。为了获得高的ACE抑制活性和短肽产率，最佳的酶解条件确定为：加酶量1767μ/g蛋白，酶解时间143min，酶解pH为10.00，酶解温度取45℃，获得的短肽生成率和ACE抑制率为82.67%和83.48%。

3结论

采用壳聚糖固定碱性蛋白酶2709水解花生蛋白制备ACE抑制肽发现：加酶量酶解时间是影响短肽生成率、ACE抑制率和水解度的高度显著因素。最佳的酶解工艺是：加酶量1767μ/g蛋白，酶解时间143min，酶解pH为10.00，酶解温度取45℃，获得的短肽生成率和ACE抑制率为82.67%和83.48%。分析短肽生成率、蛋白水解度和ACE抑制率的相互关系发现：适当增加水解度可以提高酶解产物的ACE抑制活性，但过度水解会导致ACE抑制率下降。